抗菌肽对细菌杀伤作用的分子机制

抗菌肽是一类新型的抗菌物质,从最低等的生物病毒、细菌到高等的动植物都有广泛分布. 以往的研究主要集中于抗菌肽对细菌细胞膜的作用机制,已经构建了三种作用模式. 但近几年的研究表明,很多抗菌肽都能有效地穿过细菌的细胞膜,直接与胞内分子相互作用,并不引起膜的破裂. 抗菌肽根据其结构特点有着多种杀菌穿膜的机制,其后分别与胞内的靶分子如核酸,蛋白质,信号转导通路等互相作用,最终实现对细菌的杀伤作用.     

抗真菌肽对真菌作用机制研究进展

20 世纪 90 年代初, Iijima 等从麻蝇幼虫血淋巴分离出一种具有抗真菌活性、能抑制 C.albicans 生长的蛋白质 . 到目前为止,已发现 150 多种肽具有抗真菌的特性,随着被发现的抗真菌肽数目不断增多,人们对抗真菌肽的抗真菌机理也进行了大量的研究,抗真菌肽对真菌的作用方式主要有：阻止、破坏真菌细胞壁的合成;与膜作用,在质膜上形成孔洞,使重要的内容物外泄;与真菌细胞内线粒体、核酸大分子等重要细胞器相互作用;最终导致真菌的死亡 .     

抗菌肽CM4基因克隆及其在毕赤酵母中的表达鉴定

为了在毕赤酵母中获得抗菌肽CM4表达,将抗菌肽CM4基因克隆入表达质粒pPIC9,SacⅠ线性化的重组表达质粒pPIC9-CM4电击转化P.pastorisGS115(his-),采用MM、MD板和PCR法筛选Mut 表型,甲醇诱导表达;抗菌活性检测、Tricine-SDS-PAGE及酸性活性电泳均表明抗菌肽CM4在毕赤酵母中成功地分泌表达;重组抗菌肽CM4对黑曲霉(Aspergillus niger)、绿色木霉(Trichoderma viride)都有很强的抑菌活性。     

人sBCMA cDNA的克隆、高可溶性融合表达及活性分析

BCMA是除TACI外BAFF和APRIL共用的另一细胞表面受体。为了研究sBCMA作为拮抗受体的可能及获得活性sBCMA蛋白用做结构功能研究,我们以RTPCR法从人B系非洲淋巴瘤细胞株Raji总RNA中扩增出人BCMA的全长cDNA,经克隆测序证实所克隆的基因为人BCMA。继而通过嵌套PCR扩增出胞外可溶区(sBCMA,46个氨基酸组成,含有一个6个半胱氨酸的保守CRD,构成3个二硫键)cDNA,构建原核表达载体pET43.1a( )sBCMA,在大肠杆菌菌株OrigamiB(DE3)pLysS中高可溶性融合表达出重组蛋白sBCMANusAHis6,同时克隆表达了融合蛋白NusAHis6。经Ni NTA亲和纯化后的目的蛋白进行细胞学实验表明sBCMA能特异阻断BAFF促小鼠B细胞的增殖作用,而NusAHis6则不能,证实我们所表达得到的受体胞外可溶性片段sBCMA与配体具有较高的结合活性。sBCMA融合蛋白的成功表达将为二硫键富含类蛋白的表达提供参考,并为研究其临床应用以及BAFF和APRIL受体结构和功能的关系奠定基础。     

人谷胱甘肽S-转移酶pi(GSTp)中半胱氨酸对其在细胞氧化应激下功能的影响

利用PCR定点突变技术构建人GSTp三种半胱氨酸突变体C~(47/101)、C~(14/47/101)和C~(14/47/101/169)。将CSTp 野生型和突变体表达质粒转染293细胞,以CDNB 为底物测定胞内GST 的转移酶活性,结果显示各类突变体均明显抑制了细胞内源性CST 的催化活性,具有显著的负显性(dominant nega-tive)突变体的功能;将CSTp 野生型和突变体与c-Jun、NF-kB 和p53的报告基因载体共转染,通过萤光素酶活性测定发现突变体C~(14/47/101)和C~(14/47/101/169)能明显激活c-Jun 和p21的转录活性;Western印迹分析显示突变体均能上调细胞内p21蛋白的水平,细胞存活率的测定表明GSTp 突变体能增强293细胞对H_2O_2刺激的敏感性;实验结果表明半胱氨酸残基对于维持GSTp 在对抗细胞氧化应激过程中的保护作用至关重要。     

重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的影响因素

高效表达重组蛋白 ,对于生物制药意义重大。大多数药用蛋白是糖蛋白 ,中国仓鼠卵巢细胞 (Chinesehamsterovarycell,CHO)是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多 ,从CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等方面对CHO高效表达加以阐述 ,同时提出存在的问题和未来的发展方向。     

中国产家蚕抗菌肽A基因部分序列的测定

从大肠杆菌感染的家蚕蛹提取RNA,用RT-PCR方法扩增未知抗菌肽基因片段,经过克隆测序,获得了蚕抗菌肽A基因的部分片段164 bp,为制备蚕抗菌肽A基因探针,筛选基因文库打下了基础.     

抗菌肽CM4组分的K562癌细胞染色质DNA断裂作用的SCGE研究

单细胞凝胶电泳法（ｓｉｎｇｅ ｃｅｌｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ,ＳＣＧＥ）是一种快速,敏感的检测单个哺乳动物细胞ＤＮＡ断裂的技术,也叫彗星实验（ｃｏｍｅｔ ａｓｓａｙ）。此实验首次通过ＳＣＧＥ法观察抗菌肽Ｍ４组分对人髓样白血病Ｋ５６２细胞和正常人白细胞核染色质ＤＮＡ的影响,从而进一步研究抗菌肽抗癌作用的机制。荧光显微镜观察显示经抗菌肽ＣＭ４组分处理过的Ｋ５６２癌细胞核染色质ＤＮＡ出     

中国家蚕抗菌肽基因CBM1全长cDNA序列测定及其基因结构分析

用大肠杆菌感染中国家蚕（Bombyx mori）蛹,从中提取总RNA,用RT-PCR方法获得蚕抗菌肽基因CBM1 cDNA部分片段并克隆测序,以此蚕抗菌肽基因CBM1的部分片段,设计特异性引物,用3’、5’RACE的方法,获得蚕抗菌肽基因CBM1 cDNA的全长序列;用PCR的方法,从中国家蚕蛹基因组DNA获得抗菌肽CBM1基因的700bp、1100bp左右的2个片段,初步证实中国家蚕抗菌肽基因在单倍体染色体中至少存在2个拷贝。     

中国三黄鸡可溶性B淋巴细胞刺激因子基因的克隆、表达和活性研究

通过逆转录-聚合酶链式反应,从中国三黄鸡脾组织细胞中扩增得到459bp的鸡可溶性B淋巴细胞刺激因子(CycsBAFF)基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)后高效表达了带有His6标签的包涵体形式重组蛋白,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫转印检测鉴定。表达产物经Ni2 -NTA纯化后,经透析复性得到活性目的蛋白,通过单独刺激以及与PMA共刺激体外培养的鸡法氏囊B细胞,均有明显的促法氏囊B细胞存活的效应。