SARS冠状病毒M蛋白的生物信息学研究

针对GenBank上发布的来自不同国家地区的39条SARSCoV推测M蛋白,采用生物信息学软件分析其核酸和氨基酸序列,获得其分子生物学特征,确定突变位点,预测功能结构区、Motif及抗原决定簇,比较基因突变对这些功能结构的影响.结果表明:在39个病毒株M蛋白的666 bp中,共有18个病毒株在7个位点上发生了25次变异.在M蛋白序列上预测获得3个跨膜螺旋序列和一个可能的信号肽序列.氨基酸序列的变异主要发生在其跨膜和胞外区域,胞内区域相对较少.预测发现12个Motif和7个抗原决定簇.提示突变对M蛋白的结构功能区的影响不大,也未造成M蛋白的Motif的数量和构成发生改变.对抗原决定簇的影响也主要体现在序列成分构成的改变上,在设计疫苗时,应考虑由其导致的抗原特性改变.     

一种新的心肌梗塞面积的测量方法及实验验证

这种方法以计测心肌梗塞面积的数学模型电动力学原理为依据,用Frank导联体系的正交心电图取得所需数据计算心梗面积.在狗的心肌梗塞模型上证明(1)用这种方法计算得到的梗塞面积在较大范围内(1～13cm~2)与染色后直接测得的梗塞面积密切相关.心肌损伤时r=0.97(P<0.01);心肌坏死时r=0.92(P<0.05).(2)由经纬角(φ,θ)能比较准确的判断梗塞部位.(3)经纬角(φ,θ)与方位角(α、β、γ)联合分析,又可判知梗塞是发生在心内模下还是心外模下.     

cDNA微阵列制作的优化

为了优化筛检cDNA微阵列中靶基因的最适长度、浓度及点样溶液的种类,设计持家基因betaactin和GAPDHRT PCR3对引物,产物长度在189～1078bp之间,以乙肝病毒DNA片段为阴性对照,扩增纯化后分别溶于3×SSC、50%DMSO及0.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH=9.0)中,调整浓度分别为0.5μg/μL、1.0μg/μL和1.5μg/μL,比较上述不同条件的杂交结果。结果表明,杂交具有较好的特异性,阴性对照(乙肝病毒)和空白对照(点样溶液)均未见杂交信号;3种长度的同一靶基因杂交信号强度无明显差别(betaactinP=0.378;GAPDHP=0.866);3种点样溶液中以50%DMSO杂交信号最好,较强且均匀一致(P=0.0001),其余2种差异不显著(P=0.142);3种浓度靶基因杂交信号差异不显著(P=0.648),浓度高者信号略强。短片段靶基因(200bp左右)可获得与长片段靶基因(1000bp以上)一样较好的杂交信号,点样溶液以50%DMSO效果最好,靶基因浓度为0.5μg/μL时即可得到较好的杂交结果。     

cDNA微阵列制作的优化

为了优化筛检cDNA微阵列中靶基因的最适长度、浓度及点样溶液的种类,设计持家基因beta actin和GAPDH RT-PCR 3对引物,产物长度在189～1 078 bp之间,以乙肝病毒DNA片段为阴性对照,扩增纯化后分别溶于3×SSC、50%DMSO及0.5mol/L碳酸盐缓冲液（pH=9.0）中,调整浓度分别为0.5μg/μL、1.0μg/μL和1.5μg/μL,比较上述不同条件的杂交结果。结果表明,杂交具有较好的特异性,阴性对照（乙肝病毒）和空白对照（点样溶液）均未见杂交信号;3种长度的同一靶基因杂交信号强度无明显差别（beta actin P=0.378;GAPDH P=0.866）;3种点样溶液中以50%DMSO杂交信号最好,较强且均匀一致(P=0.0001),其余2种差异不显著(P=0.142);3种浓度靶基因杂交信号差异不显著(P=0.648),浓度高者信号略强。短片段靶基因（200 bp左右）可获得与长片段靶基因（1 000 bp以上）一样较好的杂交信号,点样溶液以50%DMSO效果最好,靶基因浓度为0.5μg/μL时即可得到较好的杂交结果。 Abstract:To optimize and screen the most suitable target gene length,concentration and printing solution in cDNA microarray,housekeeping genes,such as beta actin and GAPDH,were selected as targets and hepatitis B virus gene as negative control.The RT-PCR primers that spanned at least one intron and whose products were at between 189 bp and 1 078 bp were designed with primer premier 5.0,so did the hepatitis B virus gene PCR primer.After polymerase chain reaction,the products were purified with ethanol and dissolved in 3×SSC,50% DMSO and 0.5mol/L carbonate buffer（pH=9.0）respectively.The concentrations of target genes were adjusted at 0.5μg/μL,1.0μg/μL and 1.5μg/μL.The hybridization signals had a good specificity.No signal showed in either negative control (HBV) or blank control (printing solution only).There was no significant difference in target gene lengths.The P value of beta actin (189 bp,491 bp,974 bp) and GAPDH (227 bp,552 bp,1 078 bp) was 0.378 and 0.866 respectively.There was no significant difference among concentrations（P=0.648）,too.However,the higher the concentration was,the stronger the signals would be.Among the three kinds of printing solution,50% DMSO was the best（P=0.0001）,while the other two had no difference by multi-comparison(P=0.142).The target gene at length between 200 bp and 1 000 bp has got the same hybridization signals.50%DMSO printing solution and the target gene concentration of 0.5μg/μl are suitable for good hybridization.     

SARS-CoV推测N蛋白功能结构的生物信息学研究

目的:利用生物信息学方法理论分析不同地区来源的SARS冠状病毒(SARSCoV)推断N蛋白的基因组与氨基酸序列的差异及分子生物学特征以及基因突变对蛋白结构功能的影响。方法:针对GenBank上发布的来自不同国家地区的15条SARSCoV基因组序列,采用生物信息学软件分析其推测N蛋白的CDS和氨基酸序列,分别找出突变位点并预测其等电点及功能结构域。结果:SARSCoV推测N蛋白基因组序列存在5个变异位点导致蛋白序列有4个位点发生突变。在该蛋白上发现四个有意义的低成分复杂性区域;未发现卷曲螺旋、跨膜螺旋和信号肽序列。基因突变造成4条序列在功能位点数量上减少,但未影响抗原决定簇。预测发现两个保守的Domain和一个丝氨酸富集区。结论:不同地区来源的15条推测N蛋白序列的变异很少。基因突变导致部分序列功能位点数量发生改变,但未影响抗原决定簇的数量。     

小鼠肝癌及肝正常组织B4GalT糖基转移酶家族mRNA表达差异及其对细胞膜相关糖链的影响

探讨肝癌模型鼠与正常小鼠肝组织B4GalT(β-1,4-半乳糖转移酶)家族mRNA表达差异以及对细胞膜相关糖链的影响.采用RT-PCR方法检测肝癌模型鼠和正常对照小鼠肝癌组织中B4GalT家族7个成员以及唾液酸α-2,3转移酶ST3GalⅢ、ST3GalⅣ、ST3GalⅥ、α-1,6-岩藻糖转移酶FUT8 mRNA表达差异,应用凝集素芯片检测细胞膜表面半乳糖、岩藻糖、唾液酸表达情况.结果显示:与正常对照组相比,肝癌模型鼠肝组织中B4GalT-1和B4GalT-3、ST3GalⅣ和ST3GalⅥ、FUT8呈现高表达,肝癌细胞膜半乳糖、岩藻糖、唾液酸类型糖链增加,提示B4GalT-1和B4GalT-3与肝癌细胞膜半乳糖链增加相关.由于细胞Galβ-1,4-GlcNAc糖表位在ST3GalⅢ、ST3GalⅣ或ST3GalⅥ催化下与唾液酸α-2,3连接生成s-lewis x抗原前体,本实验中B4GalT-1和B4GalT-3与ST3GalⅣ、ST3GalⅤ、FUT8 mRNA表达具有相关性,提示B4GalT-1和B4GalT-3可能与ST3GalⅣ、ST3GalⅥ以及FUT4协同作用,导致肝癌细胞膜半乳糖、岩藻糖、唾液酸类型糖链增加.     

应用凝集素芯片检测肝癌细胞膜表面糖链变化

利用凝集素糖链特异亲和原理构建对细胞膜表面糖链进行即时检测的凝集素芯片体系,检测肝癌发生过程中细胞膜糖链的变化.从H22细胞系、正常小鼠和肝癌模型鼠肝组织中提取细胞进行荧光标记,激光扫描仪检测凝集素位点捕获的细胞,根据凝集素特异亲和性确定细胞膜表面糖表达谱,显微镜下观察捕获细胞的形态.对凝集素芯片捕获细胞的最佳条件进行探讨,用甘露糖抑制试验、流式细胞仪和不同血型红细胞验证了凝集素捕获细胞的特异性.结果显示:正常和肝癌小鼠肝细胞膜表面糖链存在较大差异,正常组只有PSA、DSL、STL、NPL凝集素位点捕获到细胞,实验组只有LTL和DBA位点没有捕获到细胞,提示小鼠肝癌组织细胞膜表面糖链显著增加,细胞膜上唾液酸、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、甘露糖和半乳糖糖链表达增加,这些糖链及其相关糖蛋白可能在肝癌的发生和发展中起一定作用.该凝集素芯片有较好的稳定性和特异性,可以对细胞膜表面糖链进行动态、即时、通量的检测,为研究细胞膜表面聚糖在细胞发育和癌变等过程中的变化提供了一个技术平台.     

生物芯片在微生物学研究中的应用

生物芯片是用于检测生物样品中生物分子及生化指标的微小装置,根据其检测靶标不同分为基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片及生化芯片;根据其结构和工作原理不同分为阵列型芯片、液体芯片和微流体芯片。由于具有微量化、并行性、快速、高通量和自动化检测的特点,生物芯片被广泛地应用于生物学研究领域。本文重点论述生物芯片在微生物学研究中的应用。     

低密度cDNA芯片技术的优化

为了建立稳定的低密度cDNA芯片技术平台,研究靶基因的最适长度、浓度、点样溶液种类及杂交反应动力学,并了解该芯片的重复性与可靠性.结果表明,杂交具有较好的特异性,不同长度(189～1078bp)、浓度(0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L)的同一靶基因杂交信号强度无明显差别;以50%DMSO为点样溶液者杂交信号最好(P=0.0001).60℃杂交18h信号最佳(P<0.001).重复2次检测结果差异无显著性(P=0.348),重复性较好,其相关系数为0.588.与RT-PCR结果相比,相关系数为-0.778(P<0.0001),特异性为100%,灵敏度为80%(16/20),可靠性较好.