一种高效的灵芝菌丝体总蛋白的提取方法

灵芝基因组精细图谱的完成必将推动灵芝蛋白质组学的快速发展,因此,建立一种高效稳定的灵芝菌丝体总蛋白的提取方法是蛋白质组学研究的首要步骤。本文以灵芝菌丝为研究对象,使用超声波、液氮冷冻研磨和超声波联合液氮冷冻研磨等三种破碎细胞壁的方法,采用含不同蛋白酶抑制剂的尿素-硫脲法溶解菌丝体总蛋白,经SDS-PAGE电泳分析和蛋白浓度测定,发现液氮冷冻研磨结合尿素-硫脲溶解蛋白质的方法适合灵芝菌丝体总蛋白的提取,从每克新鲜菌丝中能提取16 g蛋白质,且蛋白质种类多,条带丰度高。     

苹果树腐烂病菌胞外蛋白提取方法

选择一种理想的蛋白提取方法,获得数量多、质量高的苹果树腐烂病菌Valsa mali胞外蛋白用于蛋白质组学分析,为全面解析该病原菌的致病机制奠定基础。采用冷冻干燥透析结合法、脱氧胆酸钠(DOC)-10%TCA沉淀法、硫酸铵沉淀法3种方法分别提取苹果树腐烂病菌的胞外蛋白,并筛选最适的硫酸铵浓度,利用Bradford法测定蛋白总量、SDS-PAGE检测蛋白条带分辨率及不同致病力菌株蛋白差异。结果表明,70%硫酸铵沉淀提取的胞外蛋白量最高、SDS-PAGE电泳可辨认蛋白条带最多。强弱致病菌株胞外蛋白的SDS-PAGE电泳图谱在37-50 kD有4条蛋白条带差异明显,由此表明,70%硫酸铵盐析法更适合用于苹果树腐烂病菌胞外蛋白质差异分析时蛋白质的提取。     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A在枯草芽胞杆菌中的表达

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis常被用于表达杀虫和抗菌蛋白.为了探讨苏云金芽胞杆菌B. thuringiensis营养期杀虫蛋白基因（vip3A）在枯草芽胞杆菌中的表达情况,促进杀虫防病工程菌构建,将枯草芽胞杆菌168菌株核糖体小亚基S4蛋白基因的启动子与苏云金芽胞杆菌WB7菌株vip3A基因的编码序列连接,插入大肠杆菌Escherichia coli与枯草芽胞杆菌穿梭载体pAD123,得到重组原核表达质粒pADpvip,将重组质粒转化枯草芽胞杆菌标准菌株168和分离自辣椒体内的生防内生枯草芽胞杆菌BS-2菌株中,获得工程菌株.SDS-PAGE分析表明在枯草芽胞杆菌168菌株的部分工程菌株中有约88 kDa大小的VIP条带,而BS-2的工程菌株中未见相应的条带,表明Vip3A蛋白仅在168菌株中表达.生物测定表明有5株168的工程菌株（168vip1-4,6）表现较高的杀虫活性,工程菌株发酵稀释液（约10⁷CFU/mL）处理的小白菜叶片饲喂斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的杀虫效果可达87.64%~92.13%,但vip3A基因转入内生枯草芽胞杆菌BS-2中不表现杀虫作用.毒力测定表明168vip2菌株对斜纹夜蛾2龄幼虫72 h的LC₅₀为0.0194 mL/mL.这些结果为进一步研究基因在枯草芽胞杆菌中的表达构建杀虫防病工程菌打下了基础.     

小麦幼穗蛋白质双向电泳条件的优化

本研究以温光敏小麦为试材,用TCA/丙酮和酚提取法提取小麦幼穗蛋白样品,进行了双向电泳优化分析,并对双向电泳过程中出现的问题进行了讨论。结果表明,用TCA/丙酮法提取小麦幼穗蛋白质其产率(浓度)高于酚提取法。SDS-PAGE电泳显示,用TCA/丙酮提取法提取的蛋白质能获得较清晰条带,分辨率较高,而酚提取法提取的蛋白质其条带模糊,分辨率低。对蛋白质纯化除盐可以提高分辨率,减少横竖纹,获得背景清晰的圆形蛋白点。通过ImageMasterTM 2D Platinum5.0软件分析凝胶图谱,结果显示纯化后可降低噪点,纯化后蛋白点数可从未纯化蛋白点数的216增加到583。显然,采用TCA/丙酮法可获得高浓度高质量的蛋白质,而进一步纯化、除盐离子可进一步获得背景清晰可高重复性的电泳图谱。在双向电泳实验过程中,观察到一些异常缺陷胶的出现,如双向电泳图谱中蛋白点扩散,蛋白聚集形成斑点串,没有点或点很少,出现纵纹横纹及图谱扭曲等影响图谱质量的严重问题,本研究对这些问题做了分析并提出了解决方案。     

蚜虫全蛋白提取方法的比较研究

为建立适于SDS-PAGE分析的蚜虫蛋白质样品制备平台,以便为蚜虫蛋白质的双向电泳分析奠定基础,本研究比较了TCA/丙酮沉淀、PEG提取、饱和酚抽提和直接裂解4种蛋白质提取方法.结果表明:不同样品制备方法的蛋白提取率有显著的差异,其中直接裂解法的提取率最高,为17.43 mg/g;其次是饱和酚抽提法,提取率为12.30 mg/g;而PEG制备法提取率最低,只有7.96 mg/g.利用SDS-PAGE电泳对不同的蛋白质样品进行了分析,发现在凝胶图谱上显现的条带也有明显的差异,其中饱和酚抽提法显现的条带数最多,为36条,且从14.4 kDa～116.0 kDa范围有广泛分布,条带清晰;PEG提取法条带数为30条,一些蛋白条带丢失或不明显;TCA/丙酮沉淀法的蛋白条带集中分布在25.0 kDa～67.0 kDa区域;直接裂解法条带数仅为24条,且小分子量的条带可辩率很低.通过以上结果可以得出,饱和酚抽提法最适用于蚜虫全蛋白样品的制备.     

海带内生芽胞杆菌DNN7和HSN2胞外蛋白抗肿瘤活性初步研究

为检测海带内生芽胞杆菌DNN7和HSN2胞外蛋白的抗肿瘤活性,用0.22μm滤膜过滤将海带内生芽胞杆菌DNN7和HSN2的菌体和发酵液分开,用硫酸铵沉淀发酵液的蛋白组分并用SDS-PAGE检测,用海虾毒性法和MTT法检测胞外蛋白的抗肿瘤活性。结果表明,海带内生芽胞杆菌DNN7的粗蛋白主要由分子量约为66×103、52×103和34×103的3条带组成,HSN2的粗蛋白主要由分子量约为44×103和52×103的2条带组成。DNN7胞外蛋白对体外慢性粒细胞白血病癌细胞K562、肝肿瘤细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231均具有较好的抑制活性,其抑制率分别高达96.46%、42.99%和85.70%;HSN2胞外蛋白对体外慢性粒细胞白血病癌细胞K562、肝肿瘤细胞HepG2和乳腺癌细胞MDA-MB-231也具有较好的抑制活性,其抑制率分别为92.65%、66.80%、88.48%。     

超声波介导质粒pET28a转化枯草芽胞杆菌的研究

揭示超声波介导下质粒DNA转化枯草芽胞杆菌发生的生物学机制,以便于枯草芽胞杆菌基因工程菌株的工业化应用。建立超声波介导质粒pET28a转化枯草芽胞杆菌的一种方法,采用扫描电镜结合理化分析检测技术研究超声波处理前后细胞的变化。结果显示,一定条件的超声(40~100 W)处理后的质粒DNA可以转化枯草芽胞杆菌,处理后的细胞在电镜下表面凹凸不平,出现褶皱现象;而且胞内蛋白质、磷脂及碱性磷酸酶(AP)大量释放至胞外。结果表明,超声波介导的DNA转化是细胞生理响应与超声波共同作用的结果。     

鸡肠源芽胞杆菌的分离、鉴定和抗菌活性

从人工饲养的健康三黄肉鸡的盲肠和大肠中分离出10株芽胞杆菌,对其进行菌落形态观察、革兰染色、芽胞染色和生理生化特性鉴定,确定为枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、球形芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌。同时测定了它们对动物病原性大肠埃希菌和链球菌的抑菌活性。其中有9株芽胞杆菌对大肠埃希菌有抑制作用,8株芽胞杆菌对链球菌有抑制作用。结果表明芽胞杆菌分离株Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8具有作为益生菌开发的潜力。     

1株枯草芽胞杆菌的鉴定及其弹性蛋白酶结构研究

鉴定弹性蛋白酶产生菌株EL32,确定该酶的基本结构。采用分子生物学、形态学及生理生化性质对菌株EL32进行鉴定;用硫酸铵沉淀、离子交换层析和分子筛层析纯化酶蛋白;借助肽指纹图谱及酶基因克隆技术研究该酶的一级结构;利用同源建模的方法研究该酶的空间结构。菌株EL32的16S rDNA与枯草芽胞杆菌16S rDNA的同源性达到99%,其菌落呈乳白色,其细胞革兰染色阳性,具有芽胞;发酵葡萄糖试验产酸不产气,明胶水解试验呈阳性,能够水解淀粉,V-P反应呈阳性,鉴定为枯草芽胞杆菌。从菌株BL32发酵液中纯化得到了弹性蛋白酶,SDS-PAGE分析显示其分子量为31 ku。用LTQ-MS测定肽指纹图谱表明该弹性蛋白酶是枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin,该酶的基因和蛋白质序列与枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin的同源性都高达99%。菌株EL32弹性蛋白酶的三维结构含有6个α-螺旋,7个扭曲的平行β-折叠以及2个反平行的β-折叠,His、Asp和Ser是其活性中心的关键基团。鉴定了1株产弹性蛋白酶的枯草芽胞杆菌,确定了其弹性蛋白酶是蛋白酶subtilisin,为该枯草芽胞杆菌蛋白酶的应用提供了基础。     

沙蛤中牛磺酸的制备研究

以沙蛤提取液中牛磺酸含量为指标,考察乙醇回流法、水煮法和预处理方法,并采用单因素和正交实验法优化工艺条件,确定了沙蛤中提取牛磺酸的最佳工艺。结果:提取牛磺酸的最佳工艺条件为:超声波破碎15 m in,60℃下80%乙醇回流40 m in,该条件下所得牛磺酸质量分数达6.41 mg.g-1原料。结论:超声波破碎与乙醇回流方法相结合,利于牛磺酸溶出,其含量提高26.9%。     

普洱茶中微生物的筛选及其安全性初步评价

目的在对普洱茶中微生物筛选和鉴定基础上对蜡样芽胞杆菌毒素基因的分布、普洱茶下调毒素基因的表达和改善肠上皮细胞的损伤进行研究。方法分别采用无菌水和沸水泡制普洱茶,获得分离株,通过16SrDNA测序以及生理生化试验确定其归属;对所筛选的菌株进行耐模拟胃肠液能力评价和毒力基因的检测;采用细胞实验和荧光定量PCR技术,研究普洱茶对蜡样芽胞杆菌毒素的抑制作用。结果无菌水浸泡普洱茶获得的45株菌中44株为芽胞杆菌属,沸水浸泡获得的7株菌均为蜡样芽胞杆菌(FBCE01、FBCE06、FBCE10、FBCE14、FBCE20、FBCE26和FBCE29),多重PCR技术结果表明其分别含有毒力基因cytK、nheA和hblD的2种或3种。耐模拟胃肠液实验表明,7株菌均具有很强的耐模拟胃肠液消化能力;细胞实验结果发现,普洱茶汤能显著降低蜡样芽胞杆菌对Caco-2细胞的粘附(P0.05);MTT实验结果显示,普洱茶能有效降低蜡样芽胞杆菌对细胞的损伤;荧光定量PCR技术结果进一步说明,普洱茶使蜡样芽胞杆菌肠毒素的mRNA表达水平下调。结论普洱茶具有抑制蜡样芽胞杆菌毒素的作用。     

地衣芽胞杆菌dif序列的功能鉴定

地衣芽胞杆菌是重要的工业菌株,如何为其建立一种有效的基因删除技术是对该菌株进行遗传改良的基础。枯草芽胞杆菌difB8序列已经被成功用于枯草芽胞杆菌多基因的删除。在分析地衣芽胞杆菌基因组序列并获得与枯草芽胞杆菌difB8以。序列十分相似的一段序列difBLi的基础上,构建了在庆大霉素抗性基因两侧具有difBLi的重组质粒pMD19-difGm和pHY-XI’：：difGm,通过电击转化法将质粒pHY-XI’：：difGm导入B．1icheniformis ATCC14580中,筛选获得了具有庆大霉素抗性的转化子。在转化子的传代过程中,重组质粒的庆大霉素抗性基因在体内Xer／dif／f位点特异性重组系统的介导下通过其侧翼的dif位点进行同源重组而被准确删除。确证了地衣芽胞杆菌中dif序列的功能,为地衣芽胞杆菌基因组中多基因的删除提供了一种新的实验途径。     

超声波法优选苦豆子中总黄酮的提取工艺研究

目的:超声波法优选苦豆子中总黄酮的提取工艺。方法:以超声波为提取方法,以总黄酮提取率为考察指标,选取乙醇浓度(体积分数)、加溶剂倍量和超声时间为考察因素,采用均匀实验和正交实验,优选苦豆子中总黄酮的提取工艺。结果:影响总黄酮提取率各因素主次为:ACB,确定最佳提取工艺为A2B3C3,即70%乙醇,加溶剂40倍量,超声提取75 min。结论:采用该工艺提取苦豆子中总黄酮,提取率较高且稳定,说明该工艺合理可行。     

高温湿热酸法破壁提取法夫酵母胞内虾青素

法夫酵母是一种能积累虾青素的红酵母, 对其进行破壁是当前虾青素工业化提取生产的瓶颈工艺。研究在高温湿热条件下,低浓度盐酸对法夫酵母破壁而提取其胞内虾青素的工艺。探讨了不同破壁温度、盐酸浓度、液料比与破壁处理时间等因素对法夫酵母破壁后虾青素及类胡萝卜素提取率的影响, 确定了高温湿热酸法破壁提取虾青素的最佳条件为: 饱和蒸汽压力 0.1 MPa (121°C), 盐酸浓度0.5 mol/L, 液料比 (V/W)30 mL/g, 破壁时间2 min。在最佳条件下进行中试放大实验, 可得到虾青素与类胡萝卜素的提取率分别为: (84.8±3.2)%, (93.3±2)%。经优化后的新破壁工艺安全高效, 不会有毒性残留, 具有良好的工业应用前景。     

Enzymatic pre‐treatment of microalgae cells for enhanced extraction of proteins

Crude proteins and pigments were extracted from different microalgae strains, both marine and freshwater. The effectiveness of enzymatic pre‐treatment prior to protein extraction was evaluated and compared to conventional techniques, including ultrasonication and high‐pressure water extraction. Enzymatic pre‐treatment was chosen as it could be carried out at mild shear conditions and does not subject the proteins to high temperatures, as with the ultrasonication approach. Using enzymatic pre‐treatment, the extracted proteins yields of all tested microalgae strains were approximately 0.7 mg per mg of dry cell weight. These values were comparable to those achieved using a commercial lytic kit. Ultrasonication was not very effective for proteins extraction from Chlorella sp., and the extracted proteins yields did not exceed 0.4 mg per mg of dry cell weight. For other strains, similar yields were achieved by both treatment methods. The time‐course effect of enzymatic incubation on the proteins extraction efficiency was more evident using laccase compared to lysozyme, which suggested that the former enzyme has a slower rate of cell disruption. The crude extracted proteins were fractionated using an ion exchange resin and were analyzed by the electrophoresis technique. They were further tested for their antioxidant activity, the highest of which was about 60% from Nannochloropsis sp. The total phenolic contents in the selected strains were also determined, with Chlorella sp. showing the highest content reaching 17 mg/g. Lysozyme was also found to enhance the extraction of pigments, with Chlorella sp. showing the highest pigments contents of 16.02, 4.59 and 5.22 mg/g of chlorophyll a, chlorophyll b and total carotenoids, respectively.     

A study of the influence of yeast cell debris on protein and alpha-glucosidase adsorption at various zones within the expanded bed using in-bed sampling

Expanded bed adsorption chromatography is used to capture products directly from unclarified feedstocks, thus combining solid-liquid separation, product concentration and preliminary purification into a single step. However, when non-specific ion-exchangers are used as the adsorbent in the expanded bed, there is the possibility that electrostatic interactions of cells or cell debris with the adsorbent may interfere with the adsorption of soluble products. These interactions depend on the particle size of the cell debris and its surface charge, which in turn depend on the extent of disruption used to release the intracellular products. The interactions occurring during expanded bed adsorption between the anionic ion-exchanger STREAMLINE DEAE and particulate yeast homogenates obtained by high pressure homogenisation at different intensities of disruption achieved by operating at different pressures were studied, while maintaining all other parameters constant. In-bed sampling from the expanded bed using ports fitted up the height of expanded bed was used to study the retention of yeast cells and cell debris within the bed and its influence on the adsorption of total soluble protein and alpha-glucosidase within various zones of the expanded bed. The retention of the biomass present in the homogenate obtained at a lower intensity of disruption was found to be high at the lower end of the column (17% from 13.8 MPa sample compared to 1% from 41.4 MPa sample). This interaction of the particulate material with the adsorbent was found to reduce the dynamic binding capacity of the adsorbent for total soluble protein from 3.6 mg/mL adsorbent for 41.4 MPa sample to 3.0 mg/mL adsorbent for 13.8 MPa sample. The adsorption of alpha-glucosidase was found to increase with an increase in the concentration of the enzyme in the feed, which increased with the intensity of disruption. Selective adsorption of 6,732 U alpha-glucosidase per mg of total protein bound, was noticed for the feedstock prepared at a higher disruption intensity at 41.4 MPa compared to adsorption of 1,262 U/mg of total protein bound for that prepared at 13.8 MPa. The selective adsorption of alpha-glucosidase due to its high concentration together with simultaneous high specific activity of the enzyme in the feed indicated the significance of selective release of enzymes during microbial cell disruption for efficient expanded bed adsorption processes.     

高效液相法测定香菇菇柄麦角甾醇的含量

采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)建立了测定菇柄麦角甾醇的含量测定方法。确定提取过程中皂化剂的种类和醇碱比后,将样品皂化,萃取后蒸干溶剂,乙醇定容测定。采用Phe-nomenex-C18色谱柱,V(流动相甲醇)∶V(水)=98∶2,流速1.0 mL/min,检测波长282 nm。结果表明:麦角甾醇线性回归方程为Y=9E+9×106X-8919.9(X:质量浓度,mg/mL),R2=0.998 9,0.01~0.30 mg/mL范围内线性关系良好,回收率为97.31%~101.95%。与紫外分光光度法所测结果比较,HPLC法测定菇柄中麦角甾醇含量灵敏、快速、准确,适用菇柄中麦角甾醇的含量测定。     

基因工程犬干扰素α的制备及纯化工艺

目的：运用基因工程技术制备高活性的重组犬仪干扰素。方法：用发酵罐大量培养工程菌,经超声破碎菌体获粗制包涵体,用1％ TritonX-100洗涤去除部分杂蛋白后,以8mol／L尿素溶解包涵体,稀释复性并超滤浓缩,用阴离子柱层析法纯化目的蛋白,测定重组犬干扰素d的活性。结果：得到的重组犬干扰素仅的相对分子质量为19×10^3,蛋白含量为0.55mg／mL,纯度95.65％,目的蛋白回收率为13.75％,活性1.78×10^7U／mL,比活性3.24×10^7U／mg。结论：制备了高纯度且具有高活性的重组犬α干扰素。     

对韭菜迟眼蕈蚊幼虫高毒力Bt资源筛选及效果评价

【目的】为开发防治韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga的生物杀虫剂,本研究评价了185株苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis对韭菜迟眼蕈蚊幼虫的杀虫活性。【方法】采用浸叶饲喂法对供试菌株进行室内生物学测定,用盆栽试验对筛选到的对韭菜迟眼蕈蚊高毒力的FPT3菌株进行防效验证,通过SDS-PAGE电泳技术对FPT3菌株的杀虫晶体蛋白进行分析,并采用Biolog微生物自动分析系统对FPT3菌株进行了生理生化测定。【结果】在1×10~8 cfu/m L浓度下,对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫3 d的校正死亡率在80%以上的菌株有12株,其中FPT3菌株对韭菜迟眼蕈蚊2龄幼虫的杀虫活性最高;FPT3菌株表达70 ku左右蛋白,具有典型的苏云金芽胞杆菌的生理生化特征;FPT3菌株对韭菜迟眼蕈蚊1龄和2龄幼虫具有较高的杀虫活性,LC_(50)分别为1.206×10~6 cfu/m L和2.577×10~6 cfu/mL,室内盆栽试验明确了FPT3菌株对韭菜迟眼蕈蚊的防治效果达77.76%。【结论】FPT3菌株能有效地控制韭菜迟眼蕈蚊的发生,具有良好的应用前景。     

枯草杆菌ylmK基因的荧光标记及Ylmk蛋白的亚细胞定位

目的：对枯草杆菌ylmK基因进行3’端荧光标记以便对其产物YlmK蛋白在菌体中的位置进行初步观察。方法：以BS168菌株基因组DNA为模板,PCR扩增ylmK基因的3’端序列,并将其克隆到载体pSGll64中,形成ylmK’-gfpmutl融合,构建重组载体pNC-424;将pNG424转化枯草杆菌168菌株,单交换形成完整的功能性3’端gfpmutl标记的ylmK基因,菌落PCR对阳性转化子BS362进行鉴定,用表面荧光显微镜技术对BS362进行观察。结果：荧光检测结果表明GFP标记的YlmK分布于菌体的外周,在位置上靠近细胞膜并与之平行排列。结论：YlmK是一种膜蛋白。