荧光偏振技术研究Bloom解旋酶催化核心与双链DNA的相互作用

Bloom 综合症(BLM)解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要的作用．BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合症,患者遗传不稳定易患多种类型癌症．本研究运用荧光偏振技术研究BLM解旋酶催化核心(BLM642-1290)与双链DNA(dsDNA)的相互作用,分析其相关特征参数,了解BLM642-1290解旋酶与dsDNA的结合和解链特性．结果表明,BLM642-1290解旋酶与dsDNA的结合和解链和dsDNA3’末端的单链DNA(ssDNA)长度有关;解旋酶优先结合于dsDNA底物的ssDNA末端,且每分子解旋酶可结合9.6 nt的ssDNA;dsDNA3’末端ssDNA的长度为9.6 nt时,解旋酶的解链效率达到最大且不再随其长度而变化．另外,BLM642-1290解旋酶也能够结合和解链钝末端dsDNA,但其结合亲和力和解链效率低于有3’末端ssDNA的dsDNA．推测BLM642-1290解旋酶在与dsDNA底物结合和解链时是单体形式,可能以尺蠖的形式解开dsDNA．这些结果可为进一步研究BLM解旋酶的功能特征提供理论基础．     

BTR复合物在DNA损伤修复中的研究进展

Bloom综合征(Bloom syndrome,BS)是一种染色体紊乱型遗传病,BS患者具有基因组不稳定性、癌症易患性以及姐妹染色单体交换增多等重要特征。BS是由人体中BLM基因突变所致,该基因编码的BLM蛋白是一种Rec Q DNA解旋酶。BLM蛋白与DNA拓扑异构酶Topo Ⅲα、Rec Q介导的基因组不稳定蛋白1和2(Rec Q-mediated genome instability protein,RMI1和RMI2)紧密结合形成BTR复合物。该复合物能够抑制姐妹染色单体交换,维持基因组稳定性,在DNA复制、重组以及修复过程中发挥重要作用。现介绍BLM蛋白,并在此基础上对BTR复合物成员之间的相互作用以及其在DNA损伤修复中的作用进行阐述。     

荧光偏振技术研究Bloom解旋酶催化核心与双链DNA的相互作用

Bloom 综合症(BLM)解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要的作用．BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合症,患者遗传不稳定易患多种类型癌症．本研究运用荧光偏振技术研究BLM解旋酶催化核心(BLM^642～1290)与双链DNA(dsDNA)的相互作用,分析其相关特征参数,了解BLM^642～1290解旋酶与dsDNA的结合和解链特性．结果表明：BLM^642～1290解旋酶与dsDNA的结合和解链与dsDNA 3′端的单链DNA(ssDNA)长度有关;解旋酶优先结合于dsDNA底物的ssDNA末端,且每分子解旋酶可结合9.6 nt的ssDNA;dsDNA 3′端ssDNA的长度为9.6 nt时,解旋酶的解链效率达到最大且不再随其长度而变化．另外,BLM^642～1290解旋酶也能够结合和解链钝末端dsDNA,但其结合亲和力和解链效率低于有3′端ssDNA的dsDNA．推测BLM^642～1290解旋酶在与dsDNA底物结合和解链时是单体形式,可能以尺蠖的形式解开dsDNA．这些结果可为进一步研究BLM解旋酶的功能特征提供理论基础．     

人前列腺癌PC3细胞Bloom解旋酶基因干扰载体的构建

通过RNAi技术干扰人前列腺癌PC3细胞Bloom(BLM)解旋酶基因的表达。实验前期根据BLM解旋酶基因序列设计并合成两对sh RNA,插入到CMV-cop GFP-T2A-Puro-H1-mcs载体,构建针对BLM解旋酶基因的重组干扰载体CMV-cop GFP-T2A-Puro-H1-mcs-BLM1、CMV-cop GFPT2A-Puro-H1-mcs-BLM2。经测序载体构建成功后,用脂质体将所构建的载体及阴性对照载体转染前列腺癌PC3细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测转染细胞的BLM解旋酶表达情况。检测结果显示,成功构建了BLM解旋酶RNAi真核表达载体;利用脂质体转染PC3细胞后,荧光定量PCR和Western blot鉴定结果表明,BLM解旋酶的表达水平显著降低,即Bloom RNAi真核表达载体在m RNA和蛋白质水平阻断了BLM解旋酶的表达。     

洛美沙星对Bloom综合征解旋酶生物学特性影响的机理研究

Bloom综合征解旋酶(BLM)是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要作用.BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合征.Bloom综合征是一种罕见隐性常染色体遗传疾病,患者遗传不稳定,并易患多种类型癌症.洛美沙星(LMX)可以抑制细胞内多种酶,并通过结合DNA干扰DNA代谢,从而治疗多种疾病,但是其具体的作用机理还未完全清楚.运用荧光偏振技术和自由磷检测技术,研究了LMX对BLM642～1290解旋酶DNA结合活性、解链活性和ATP酶活性的影响.运用荧光及紫外吸收光谱法研究了LMX与解旋酶结合的结合常数、结合位点数、作用力类型、结合距离等参数.结果表明,LMX与解旋酶之间能自发进行反应,两种分子有一个结合位点,通过静电引力和疏水作用力形成稳定的BLM-LMX复合物,且解旋酶的内源荧光被LMX静态猝灭,主要原因是非辐射能量转移.在这一过程中,LMX能抑制解旋酶的解链活性和ATP酶活性,而促进解旋酶的DNA结合活性.LMX对BLM解旋酶生物学活性影响的机理可能是LMX使解旋酶通过别构机制影响其ATP酶活性,并使酶的构象维持在较低解链活性的状态,通过抑制ATP催化水解与解链过程的偶联和阻止解旋酶的易位,从而抑制其解链.LMX能够促进解旋酶的DNA结合活性,可能是因为其C-6和C-7上的取代功能基团可以增加酶活力,以及增强药物、酶和DNA的结合,从而形成药物-酶-DNA复合物.这些结果为研究以DNA解旋酶为药物靶标的分子机理和理解喹诺酮类药物的作用机理奠定相关理论基础.     

介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点鉴定

BLM解旋酶是人RecQ DNA解旋酶家族重要成员之一,在机体的DNA复制、重组、损伤修复以及维护基因组稳定性等方面发挥重要作用。早期研究表明,BLM解旋酶通过自身携带的核定位信号（nuclear localization signal, NLS）进入细胞核,但是介导其细胞核定位的关键氨基酸位点尚不清楚。本研究构建了BLM解旋酶C端(aa642 1417)截短体克隆,首先通过截短表达的方法确证其NLS结构域。在此基础上,构建重组真核表达载体pEGFP NLS/BLM NES/Rev,通过观察BLM NLS碱性氨基酸位点突变对EGFP NLS/ BLM NES/Rev融合蛋白细胞核定位的影响,以此快速鉴定NLS中介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点。结果表明,BLM(aa642 1417) C端截短体具有与全长BLM解旋酶相同的细胞核定位,同时确证1344RSKRRK1349是BLM解旋酶NLS结构域的活性位点,且具有与SV40 NLS相同的核输入能力。氨基酸位点突变试验结果表明,R1344A、K1346A、R1348A和K1349A点突变均减少了EGFP NLS/BLM NES/Rev和EGFP BLM(642 1417)融合蛋白的细胞核定位。因此,这4个位点是介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点。此结果为后续研究BLM解旋酶细胞核定位的分子机制奠定了基础。     

甘草次酸对Bloom解旋酶生物学特性的影响

甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)是甘草主要活性组分,可诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长.然而,其对BLM解旋酶的抑制作用尚未见报道.本文注视甘草次酸对BLM解旋酶构象、二级结构和生化活性的影响.圆二色光谱和紫外光谱分析显示,GA可破坏BLM642-1290解旋酶α-螺旋结构,改变其构象,并具有2个结合位点.采用荧光偏振技术和自由磷检测证明,GA以浓度依赖的方式抑制BLM642-1290解旋酶与底物dsDNA及ssDNA的结合,抑制BLM642-1290解旋酶活性及ATP酶活性,且抑制类型为混合抑制.综上所述,本文证明GA可通过结合BLM解旋酶,改变BLM解旋酶构象,抑制BLM解旋酶与DNA的结合,从而抑制BLM解旋酶的生化活性.我们的发现将对深入认识GA的抗肿瘤作用有新的启示.     

BLM解旋酶基因的克隆、表达载体构建及表达研究

克隆获得BLM基因全长CDS区,研究其在细胞中的表达情况。从人前列腺癌PC3细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,采用分段克隆的方法获得BLM全长CDS区,将其定向插入到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-N3,构建p ET-32a-BLM和p EGFP-N3-BLM。将获得的重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞或转染PC3细胞,通过SDS-PAGE、Western blotting、荧光定位观察等方法研究人BLM解旋酶在细胞中的表达或定位。BLM解旋酶的原核表达结果显示,不同IPTG浓度对BLM解旋酶的表达量影响不大,低温有助于其表达量的提高。Western blotting检测发现,构建的人BLM解旋酶重组原核和真核表达载体分别能在大肠杆菌细胞和PC3细胞中表达出分子量约为179 kD的蛋白质,与预期分子量大小一致。荧光共定位结果显示,人BLM解旋酶主要定位在细胞核。成功克隆了人BLM解旋酶全长CDS区,且构建的重组表达载体pET-32a-BLM和pEGFP-N3-BLM能在相应的宿主细胞中正确表达。     

CRISPR/Cas9技术敲除人前列腺癌PC-3细胞BLM解旋酶基因的研究

BLM解旋酶是人类RecQ解旋酶家族的重要一员,在DNA的复制、修复、重组、转录、端粒的维持等细胞代谢过程中具有重要的作用。BLM基因与前列腺癌易感性相关,可作为治疗前列腺癌的候选基因。该研究设计了5个Cas9/SgRNA载体,并通过T7E1酶筛选出活性最强的SgRNA3载体,利用脂质体LTX将其与供体载体共同导入前列腺癌PC-3细胞。BLa和Puro抗性筛选及荧光蛋白标记甄别获得带阳性标记的细胞。Western blot及RTq-PCR检测证明,前列腺癌PC-3细胞中的BLM解旋酶基因被成功敲除,为深入研究BLM解旋酶基因在前列腺癌中的作用提供了重要的科学数据。     

大肠杆菌RecQ解旋酶的生物学活性分析

RecQ家族解旋酶是DNA解旋酶中高度保守的一个重要家族,在维持染色体的稳定性中起着重要的作用.人类RecQ家族解旋酶突变会导致几种与癌症有关的疾病.本研究旨在诱导大肠杆菌RecQ解旋酶体外表达,并应用生物化学和生物物理学技术研究大肠杆菌RecQ解旋酶的生物学活性.体外诱导表达获得纯度达90%以上并具有高活性的大肠杆菌重组RecQ解旋酶,其可溶性好;经生物学活性分析显示具有DNA结合活性、ATP依赖的DNA解链活性、DNA依赖的ATP酶活性.较之双链DNA(dsDNA),大肠杆菌RecQ解旋酶更容易与单链DNA(ssDNA)结合(P0.01),但与长度不同的dsDNA的结合特性有差异(P0.01)而与ssDNA没有差异(P0.05);大肠杆菌RecQ解旋酶对3种dsDNA的解链速率不同(P0.05);大肠杆菌RecQ解旋酶的ATP酶活性与辅助因子ssDNA长度也呈正相关(P0.01).这些研究结果将有助于阐明大肠杆菌RecQ解旋酶的分子作用机制,并为研究RecQ解旋酶家族其它成员的结构与功能提供帮助。