人白血病抑制因子基因LIF的克隆、真核表达及活性检测

白血病抑制因子 (LIF)是一种多功能细胞因子 ,在生物发育及维持正常生理功能中发挥着重要的作用。以成人血细胞的总RNA为模板 ,利用RT PCR方法从成人外周血细胞中扩增人白血病抑制因子 ,而后将其克隆到真核表达载体pcDNA3,在哺乳动物细胞中成功表达。将分泌到细胞培养基中的LIF因子收集 ,通过LIF信号转导通路下游蛋白质STAT3磷酸化水平的检测、EMSA实验以及荧光酶报告系统检测 ,发现其具有激活STAT3信号通路的生物学活性。同时 ,[3H] TdR参入实验的结果也表明 ,所表达LIF因子能显著抑制鼠骨髓白血病细胞系M1的增殖。     

SIPAR和STAT3相互作用并对其信号通路进行负调控

STAT3 对细胞的生长、存活、增殖以及机体的发育都具有重要的作用 . STAT3 基因的失活可以引起多种疾病,而 STAT3 基因的过度激活又可以引发很多癌症 . 为了对 STAT3 信号通路的调控做进一步的研究,采用酵母双杂交的方法,以 STAT3 蛋白全长作为诱饵蛋白,筛选了小鼠 7 天的胚胎文库 . 得到了与 STAT3 相互作用的一个功能未知的蛋白质,将其命名为 SIPAR (Stat3 interacting protein as a repressor). 免疫染色的实验结果表明, SIPAR 是一种在核内分布为主,细胞质中也有少许分布的蛋白质 . 荧光酶活性测定结果表明 SIPAR 对 STAT3 的转录活性具有抑制作用 . 斑马鱼注射实验说明 SIPAR 基因表达严重影响了斑马鱼的正常发育 .     

白血病抑制因子 LIF 第 29 位氨基酸 突变导致其功能完全丧失

白血病抑制因子 (LIF) 为一种多功能细胞因子,在生物发育及维持正常生理功能中发挥着重要的作用. LIF 在所有的哺乳动物中都具有高度的保守性,某些氨基酸在不同物种中保持不变. LIF 中 29 位氨基酸在所有的哺乳动物中都是Q. 为了研究 Q 对 LIF 功能的重要性,利用随机 PCR 的方法将 29 位氨基酸突变为 R,并将突变后的 LIF 克隆到真核表达载体 pcDNA6 ,在哺乳动物细胞中成功表达. 同时以克隆到的野生型 LIF 作为对照. 将分泌到细胞培养基中的野生型和突变 LIF 因子收集,通过 EMSA 实验以及荧光素酶报告系统检测,发现野生型 LIF 因子具有激活 STAT3 信号通路的生物学活性. 同时, ³H-TdR 掺入实验结果表明,野生型 LIF 因子能显著抑制鼠骨髓白血病细胞系 M1 的增殖. 而 29 位氨基酸突变的 LIF 因子则完全丧失了以上功能,但所发现的突变没有显性负的作用. 结果充分说明, LIF 中高度保守的 29 位氨基酸对 LIF 功能的维持具有重要的作用.