过表达亚甲基四氢叶酸脱氢酶对高山被孢霉脂质合成的影响

高山被孢霉是一种富含多不饱和脂肪酸的丝状真菌,但其脂质过程中NADPH的来源还没有研究透彻。以高山被孢霉(尿嘧啶营养缺陷型)作为出发菌株,研究亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD1)对高山被孢霉脂质合成的影响。首先构建了过表达载体pBIG2-ura5s-MTHFD1,采用根癌土壤杆菌介导转化真菌的方法,将二元表达载体转化进高山被孢霉CCFM501中,在筛选培养基SC-CS平板上进行筛选,进而得到稳定遗传MTHFD1基因的过表达菌株(MA-MTHFD1);其次提取MA-MTHFD1菌株基因组进行PCR鉴定,并结合qPCR分析结果,表明MTHFD1基因成功在高山被孢霉中实现了过量表达;最后通过对MA-MTHFD1中的脂肪酸含量、NADPH含量及NADPH合成途径中相关基因转录水平进行分析,研究MTHFD1基因过表达对脂质合成的影响。实验结果表明,过表达MTHFD1基因可以提高高山被孢霉脂质合成能力。与原养型高山被孢霉相比,MA-MTHFD1菌株中脂肪酸含量提高了40.13%,NADPH的含量提高了26.45%,而且NADPH合成途径中其他相关基因苹果酸酶(ME)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)的转录水平也发生了上调。这一系列研究结果表明,在高山被孢霉脂质合成还原力形成中,MTHFD1基因起到了关键作用。这为解析高山被孢霉中NADPH来源及深入研究脂质合成机制,从而对其胞内脂肪酸代谢通路进行分子水平上的改建提供了一定的理论依据。     

不同身体质量指数人群肠道菌群结构及共存网络解析

[背景] 人体能量稳态失衡表现为体重过轻、超重和肥胖,肠道菌群与人体能量稳态的维持有关,但不同身体质量指数（Body Mass Index,BMI）人群的肠道菌群特征仍需进一步探究。[目的] 基于美国肠道计划公开数据库,解析4类BMI人群肠道菌群的特征,并探究4类BMI人群肠道菌群共存网络特征及差异,为基于肠道菌群来干预肥胖及体重过轻等不健康状态提供新的理论依据。[方法] 从美国肠道计划数据集中筛选具有BMI信息的肠道菌群样本,并根据世界卫生组织规定的BMI划分标准将筛选后的样本分为4类：体重过轻（BMI<18.5 kg/m²）,正常体重（18.5 kg/m²2）,超重（25 kg/m²2）,肥胖（BMI>30 kg/m²）;通过计算和比较肠道菌群的α多样性和β多样性探究4类BMI人群肠道菌群的整体结构特征及差异;通过多元线性回归模型对不同BMI分类与肠道菌群进行相关性分析,并且将地域、年龄、性别因素作为混杂因素加入到模型中进行校正;采用SparCC分别计算4类BMI人群肠道菌群中菌属相关性,并分别构建肠道菌群共存网络。[结果] 经过Wilcoxon秩和检验,发现体重过轻、超重、肥胖人群的肠道菌群α多样性都显著低于正常体重人群;β多样性分析结果表明4类BMI人群肠道菌群的整体结构存在显著差异;4类BMI人群肠道中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对含量无显著差异;通过MaAsLin分析,并且将地域、年龄、性别因素作为混杂因素加入到模型中进行校正,共得到49个与BMI类型显著相关的物种;4类BMI人群肠道菌群共存网络的拓扑结构具有一定差异,体重过轻和正常体重人群肠道菌群共存网络的复杂度较高,超重和肥胖人群肠道菌群共存网络的复杂度较低。[结论] 4类BMI人群肠道菌群的多样性、整体结构和共存网络间均存在差异。     

肥胖人群肠道菌群特征分析及机器学习模型

【背景】肠道菌群与人体健康之间的关系吸引了越来越多的关注,成为目前热门的研究热点。【目的】基于美国肠道计划公开数据库,对肥胖和健康人群肠道菌群进行比较分析,解析肥胖人群肠道菌群特征,并基于肠道菌群建立机器学习模型预测人群肥胖的状态,为基于肠道菌群干预肥胖提供理论基础。【方法】从公开数据库中获取美国肠道计划中的肠道菌数据,经过筛选得到1 655个健康(18.530)成年人的肠道菌群数据。针对α多样性,进行了Wilcox秩和检验分析并通过logsitic回归判定α多样性与肥胖之间的关系;对Unweighted Unifrac、Weighted Unifrac和Bray-Curtis三种β多样性距离进行主成分分析(principal component analysis,PCA),探索肥胖与健康人群在肠道菌群组成上的差异;对于物种差异,进行Wilcox秩和检验探索差异菌属;通过PICRUSt分析预测可能的代谢通路,同时与肠道菌群进行相关性分析。利用Scikit-Learn软件包基于属水平的肠道菌群数据建立肥胖分类机器学习模型,并进行网络搜索确定最佳模型参数。【结果】经过Wilcox秩和检验,发现肥胖人群的α多样性都较健康人群显著下降,logistic回归表明α多样性与人体肥胖状态有相关性。经过基于Weighted unifrac、Unweighted unifrac和Bray-curtis三种距离的PCA,肥胖和健康人群的肠道菌群结构上无明显差异;在门水平上,肥胖人群中的Firmicutes和Bacteroidetes比值较低,在属水平上共发现57个在两组之间具有显著性差异的属,其中肥胖人群中的Ruminococcus相对丰度较高,而Prevotella、Akkermansia和Methanobacteriales的相对丰度较低;PICRUSt预测的代谢通路有63个代谢通路在两组之间具有显著差异;梯度提升回归树对于基于肠道菌群预测肥胖人群效果最好,受试曲线下与坐标轴围成的面积(area under curve,AUC)值可以达到0.769,测试集精度可以达到0.725。【结论】基于大规模的肠道菌群数据揭示了肥胖人群肠道菌群的特征,将机器学习运用到肥胖预测上面,为精准膳食、精准医疗提供新的研究思路和理论基础。     

高山被孢霉亚甲基四氢叶酸脱氢酶的克隆、表达和功能鉴定

叶酸代谢途径中的亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD）可将5,10-亚甲基四氢叶酸氧化为5,10-甲炔基四氢叶酸,此过程会生成NADH或NADPH。对高山被孢霉中的MTHFD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明脂质合成所需还原力NADPH的来源。首先对MTHFD序列进行分析,并以pET28a（+）质粒为载体构建了MTHFD的表达载体,然后转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用比色法分析酶反应产物,表明纯化蛋白质具有MTHFD活性。高山被孢霉MTHFD对NAD⁺和NADP⁺均具有催化能力,但更偏好于将NADP⁺转化为NADPH。最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现MTHFD的转录水平在脂质开始积累后发生了明显的上调,表明MTHFD在高山被孢霉脂质合成过程中发挥重要作用,很可能是脂质合成所需NADPH的关键来源。这为对高山被孢霉进行分子改造,使之成为高产各种多不饱和脂肪酸的细胞工程提供了理论依据。