IL34转基因小鼠的建立和表型分析

目的建立白介素34转基因小鼠,研究该基因在小鼠中表达对小鼠免疫系统的作用。方法把人的IL34基因插入CMV启动子下,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立IL34转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定IL34转基因小鼠的基因表型,Western blotting检测IL34蛋白的表达水平,组织化学染色观察IL34转基因小鼠重要器官的病理改变。结果建立了2个品系的IL34转基因小鼠。转入的人IL34基因在脾脏中的表达水平高于内源性IL34。组织学分析显示IL34转基因小鼠各重要器官如脑,心,肝,肾,肠等的形态结构均正常,但脾脏的生发中心比较活跃,白髓的范围比野生型小鼠大。结论成功建立了IL34转基因小鼠,IL34基因的过度表达对免疫系统作用需要进一步探讨。     

枯草杆菌脂肪水解酶LipA和LipB

源自枯草杆菌的分泌型脂肪水解酶LipA及LipB已经被克隆、表达并表征. 它们的分子结构特点、催化机理也已经被深入研究. 枯草杆菌脂肪水解酶因为具有较好的食品工业及化学工业等方面的应用潜力,已经吸引了越来越多的关注. 通过定向进化及高通量筛选的方法对酶分子进行改造,提高其热稳定性及立体选择性是近年的研究热点. 结合国外及本研究组的工作,本文对LipA和LipB的生化性质、结构特点以及采用基因工程突变的方法进行分子改造等方面的研究进展做一简要综述. 另外,对其中一些研究论文做了简要的评价,并提出对未来工作的展望.     

大质粒转染人源心室肌Ac16细胞条件探究

该研究主要针对大质粒转染人源心室肌Ac16细胞的方式及最适条件进行摸索.采用人源心室肌Ac16细胞作为研究模型,分别用Lip3000转染、核酸脂质体(Hieff TransTM Liposomal)转染和慢病毒转染三种方法将外源大质粒pLenti-CasRx-EGFP导入Ac16细胞中,通过统计表达绿色荧光蛋白的阳性细...     

应用CRISPR/Cas13b编辑技术治疗TNNT2R141W转基因小鼠的扩张型心肌病

本研究旨在应用CRISPR/Cas13b系统对TNNT2R141W转基因扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）小鼠（DCM小鼠）进行探索性治疗,尝试发现治疗扩张型心肌病的一种新方式,为CRISPR/Cas13b系统在体内应用提供实验基础。随机设计11种Cas13b-TNNT2 gRNA并成功构建表达质粒,把它和人源TNNT2过表达质粒共同转染到293T细胞中,通过实时定量PCR（quantitative real-time PCR,Q-PCR）检测人源TNNT2 mRNA的表达水平。结果显示,gRNA 2引导Cas13b敲低目标基因的效率最高,达到80%（P<0.0001）。把gRNA2表达质粒包装到慢病毒载体中转导出生后1天的DCM小鼠原代心肌细胞,Q-PCR检测结果表明CRISPR/Cas13b系统对人源TNNT2 mRNA的敲低效率达到55%（P<0.01）。把PspCas13b和gRNA2的表达载体分别包装到AAV9病毒载体中,然后将200 μL 约1×1012 AAV9病毒颗粒通过尾静脉注射到4月龄DCM小鼠体内,待注射小鼠发育至5月龄时,Q-PCR检测结果显示,AAV9+DCM组TNNT2R141W表达水平较未注射组对照明显下降至40%（P<0.01）。对5月龄野生型（WT）、DCM（未注射病毒组）和AAV9+DCM（基因组编辑工具注射组）三组小鼠的心脏形态、心功能、心肌纤维化和心力衰竭等表型的观察结合显示：DCM小鼠的心脏形态异常,而AAV9+DCM小鼠心脏形态趋于正常;对三组小鼠的心脏进行超声心动图并对心功能指标进行统计发现,DCM组较WT组小鼠的左心室射血分数（left ventricular percent ejection fraction,LV EF%）、左心室短轴缩短率（left ventricular percent fractional shortening,LV FS%）分别下降了50.4%（P<0.0001）,55.1%（P<0.0001）,而AAV9+DCM组较DCM组小鼠的LV EF%、LV FS%分别上升了66.5%（P<0.01）,77.0%（P<0.01）;通过Q-PCR和天狼星红染色检测三组小鼠的心脏纤维化程度,结果显示DCM组较WT组小鼠的Col3a1和Postn两种纤维化基因,分别高表达5.2倍（P<0.001）、4.5倍（P<0.01）,而AAV9+DCM组较DCM组小鼠两种基因表达分别下降了2.0倍（P<0.05）、1.4倍（NS）,天狼星红染色结果显示纤维化区域明显下降;通过Q-PCR和蛋白质免疫印迹分别检测三组小鼠的心脏心力衰竭基因Nppb mRNA和Nppa蛋白质的表达水平,结果表明DCM组较WT组小鼠Nppb mRNA表达上升14.2倍（P<0.01）,而AAV9+DCM组较DCM组小鼠Nppb mRNA表达明显下降下降2.8倍（P<0.05）,Nppa蛋白质表达趋势与Nppb相同。把gRNA 5和含有R141W突变（gRNA 5T）和正常的TNNT2 mRNA（gRNA 5V）序列分别组合转染到293T细胞中,通过Q-PCR检测两种序列mRNA的表达水平。结果显示,gRNA 5T序列表达效率为30%（P<0.0001）,而并未检测到gRNA 5V mRNA的敲低。本研究通过设计靶向TNNT2R141W mRNA的gRNA,特异性敲低TNNT2R141W转基因小鼠体内突变的mRNA,有效改善了转基因小鼠的心功能,为临床进一步探索扩张型心肌病的治疗奠定了实验室基础。     

心脏特异表达肾素（原）受体转基因小鼠的建立

目的建立心脏特异表达（p）RR的转基因小鼠,研究（p）RR在心肌病发病过程中的调节作用。方法将（p）RR基因插入到心脏特异表达启动子α-MHC下游,构建转基因表达载体,通过显微注射的方法建立（p）RR转基因小鼠,PCR法鉴定转基因小鼠的基因型;Western blot和免疫组化的方法检测（p）RR在心脏组织中的表达;利用小动物超声仪检测转基因小鼠的心脏结构和功能;双色免疫荧光共聚焦进行（p）RR蛋白在转基因小鼠中的亚细胞定位,Western blot方法检测了钙泵（ATP2A2）、钠-钙交换体1（NCX 1）以及肌钙蛋白T（cTnT）在转基因小鼠心脏组织中表达量的变化情况。结果建立了心脏高表达（p）RR的转基因小鼠品系;内源性和转基因高表达的（p）RR蛋白均定位在细胞内高尔基体和内质网上;心脏特异高表达（p）RR蛋白使小鼠心脏收缩功能增强,主要表现在与同窝阴性对照小鼠相比,转基因小鼠收缩期左室内径（LVID,systolic）降低9%（P〈0.05,n=18）,收缩期容积（LVESV,systolic）减少了23%（P〈0.05,n=18）,射血分数EF（ejection fraction）升高14%（P〈0.01,n=18）,短轴缩短率FS（fraction shortening）升高20%（P〈0.01,n=18）;和心脏收缩功能和钙离子相关的ATP2A2和NCX 1表达均下调,而cTnT表达量上调。结论在心脏中过表达（p）RR能够引起心脏收缩功能明显增强,同时直接或间接调节ATP2A2、NCX 1和cTnT表达。提示（p）RR可能是调节心脏中的钙离子而参与影响心肌功能。     

系统表达HB-EGF转基因小鼠的建立

目的建立系统表达肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF）的转基因动物模型,利用转基因动物模型研究HB-EGF与组织纤维化的关系。方法RT-PCR法克隆小鼠HB-EGF基因,将其插入Chickenβ-actin启动子下游,构建Chickenβ-actin-HB-EGF表达载体,利用显微注射的技术把表达载体注射到受精卵的雄原核中,建立HB-EGF转基因小鼠。利用特异引物PCR的方法鉴定转基因的基因型,采用Western Blot方法鉴定HB-EGF基因在全身组织的表达。分别取HB-EGF转基因鼠与同窝阴性小鼠的肝、肾、肺及膀胱组织进行Massion染色。结果建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,Western Blot发现其HB-EGF在肝、肺、肾及膀胱的表达与同窝阴性对照小鼠相比明显增加。Massion染色结果表明转基因鼠肝、肺、肾及膀胱组织纤维化程度明显高于同窝阴性对照小鼠。结论成功建立了系统表达HB-EGF转基因小鼠,HB-EGF的过度表可显著加重组织纤维化程度。     

Dworf序列增强GFP荧光强度

荧光蛋白质是重要且常用的标签蛋白质,但是在没有强启动子的情况下表达量低,会影响检测的灵敏度。DWORF（dwarf open reading frame）是由NONMMUG026737 编码的长度为34个氨基酸的短肽,其mRNA 5′端能够启动下游基因表达。Kozak序列是现今唯一一个位于成熟mRNA 5′端的增强子,能够提高基因在蛋白质水平的表达,但对某些基因在蛋白质水平的表达增强效果不理想。为了检测DWORF mRNA 5′端（命名为DW）是否能够通过提高荧光蛋白质基因在蛋白质水平的表达,从而增强荧光强度,我们设计了如下实验：将DWORF mRNA 5′端与绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP)构建到表达载体中（命名为DW-GFP）,转染细胞后检测荧光强度,发现与对照组相比,转染DW-GFP质粒的细胞荧光强度显著提高（56.82 ± 1.77 vs. 45.97 ± 0.44, P<0.05）。为了便于后续应用,将DW截短到18个碱基（命名为DW18）,仍能显著提高GFP的荧光强度（33.57 ± 1.11 vs.25.34 ± 0.98, P<0.05）,且比Kozak序列提高6.80%。同时,我们发现DW18与Kozak序列同时存在能够进一步提高GFP的荧光强度,比Kozak序列单独存在时提高13.58%。本研究证明DWORF序列及其截短形式（DW18）能够有效提高表达效率,为研究低丰度蛋白质的生物学功能提供了可能的方法和工具。     

心脏特异抗凋亡蛋白ARC研究进展

含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子（apoptosis repressor with CARD,ARC）蛋白是20世纪末发现的在心肌、骨骼肌和大脑等终末分化组织中大量表达的抗凋亡蛋白。ARC的主要功能是抗凋亡作用。由于其在心脏中表达的特异性和抗凋亡的多层次性,使ARC在心脏中的作用成为近年来研究的热点。本文主要对其抗凋亡途径以及近年来在心肌病中的研究进展两方面进行综述。     

一种包含转座子Sleeping Beauty和PiggyBac的新型多功能载体的构建

DNA转座子作为一种遗传学工具对脊椎动物的转基因、突变体产生、癌基因发现和基因治疗方面都有巨大的贡献. 目前,哺乳动物中应用最为广泛、活性最高的DNA转座子为重构于鲑鱼的Sleeping Beauty (SB)转座子和来源于甘蓝蠖度尺蛾 (cabbage looper moth Trichoplusia ni)的PiggyBac (PB)转座子. 本研究中,我们成功构建了包含PB和SB两种转座子的杂合转座载体,命名为PBSBD. 在杂合转座载体中融入了基因捕获框及loxp/Frt元件,用以实现转座过程中的基因捕获和条件性敲除. 在HepG2细胞中通过检测报告基因的表达情况及阳性克隆的定位,对构建的杂合转座载体PBSBD进行了活性的初步验证. 结果表明,PBSBD能够有效被2种转座酶识别,并能检测到报告基因的表达. 本研究所构建的杂合转座载体PBSBD结合2种转座酶,可以应用于大规模筛选突变基因和研究基因功能. 并且该杂合转座载体还可以利用SB转座酶的邻近转座特性,结合载体内所包含的loxp/Frt元件用以邻近区域DNA片段的条件性敲除,研究大片段DNA在生物体中的作用.     

PiggyBac转座酶转基因小鼠模型的建立

目的 建立表达PiggyBac转座酶转基因小鼠模型,为研究PiggyBac转座子介导基因修饰在小鼠中的应用提供工具.方法 利用Cytomegalovirus( CMV)启动子驱动PiggyBac转座酶基因的表达,经显微注射法建立C57BL/6J表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测PiggyBac转座酶在小鼠生殖系睾丸中的表达情况.PiggyBac转座酶转基因小鼠活性的检测,是通过与转座子供体转基因小鼠杂交检测供体位置变化来确定的.结果 显微注射产生7只转基因小鼠并能传代,经RT-PCR筛选出一株在睾丸中相对高表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠.随后与转座子供体转基因小鼠杂交,子代双阳小鼠与野生型小鼠杂交基因型分离,产生的子代转座子供体单阳性小鼠中具有转座子供体片段的转座反应.结论 成功建立了表达PiggyBac转座酶转基因小鼠动物模型,该模型为PiggyBac转座子技术在小鼠中的应用提供了有价值的工具动物.