大鼠Bdnf基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

骨髓间质干细胞(MSCs)是目前基因工程正在探讨应用的靶细胞,为构建带有脑源性神经营养因子(Bdnf)基因慢病毒载体并使其在大鼠骨髓间质干细胞中表达,采用RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区(CDS)片段,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MSCs(rMSCs)后,PCR和免疫细胞化学法检测在rMSCs中Bdnf基因的插入和表达。结果显示所获的Bdnf基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为6.7×10~7TU/mL,PCR证实Bdnf基因插入病毒基因组。感染rMSCs后RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western检测各组细胞均有BDNF蛋白表达,其中试验组BDNF-rMSCs更大量表达BDNF,与其余2组(Mock-rMSCs、rMSCs)比较差异具有统计学意义。构建带有Bdnf基因慢病毒载体并在大鼠骨髓间质干细胞中成功表达,为今后基因修饰干细胞的移植后长期观察研究奠定了基础。     

大鼠Bdnf基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

骨髓间质干细胞（MSCs）是目前基因工程正在探讨应用的靶细胞,为构建带有脑源性神经营养因子（Bdnf）基因慢病毒载体并使其在大鼠骨髓间质干细胞中表达,采用RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区（CDS）片段,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES₂-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MSCs（rMSCs）后,PCR和免疫细胞化学法检测在rMSCs中Bdnf基因的插入和表达。结果显示所获的Bdnf基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为6.7×10⁷TU/mL, PCR证实Bdnf基因插入病毒基因组。感染rMSCs后RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western检测各组细胞均有BDNF蛋白表达,其中试验组BDNF-rMSCs更大量表达BDNF,与其余2组(Mock-rMSCs、rMSCs)比较差异具有统计学意义。构建带有Bdnf基因慢病毒载体并在大鼠骨髓间质干细胞中成功表达,为今后基因修饰干细胞的移植后长期观察研究奠定了基础。     

用聚合酶链反应检测T细胞白血病／淋巴瘤中HTLV－I前病毒DNA

用聚合酶链反应检测Ｔ细胞白血病／淋巴瘤中ＨＴＬＶ－Ｉ前病毒ＤＮＡ陈国敏,何士勤,王柠,张永利,曾毅（中国预防医学科学院病毒学研究所北京１０００５２）关键词聚合酶链反应（ＰＣＲ）,人Ｔ淋巴细胞病毒Ｉ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）,前病毒,基因整合目前,国内对人Ｔ淋...     

大鼠Bdnf基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

骨髓间质干细胞（MSCs）是目前基因工程正在探讨应用的靶细胞,为构建带有脑源性神经营养因子（Bdnf）基因慢病毒载体并使其在大鼠骨髓间质干细胞中表达,采用RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区（CDS）片段,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES₂-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MSCs（rMSCs）后,PCR和免疫细胞化学法检测在rMSCs中Bdnf基因的插入和表达。结果显示所获的Bdnf基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为6.7×10⁷TU/mL, PCR证实Bdnf基因插入病毒基因组。感染rMSCs后RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western检测各组细胞均有BDNF蛋白表达,其中试验组BDNF-rMSCs更大量表达BDNF,与其余2组(Mock-rMSCs、rMSCs)比较差异具有统计学意义。构建带有Bdnf基因慢病毒载体并在大鼠骨髓间质干细胞中成功表达,为今后基因修饰干细胞的移植后长期观察研究奠定了基础。     

慢病毒载体介导Bdnf基因修饰的骨髓间质干细胞移植治疗脑梗死

为研究经Bdnf基因修饰的骨髓间质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)对脑梗死的协同治疗作用, 构建带有大鼠Bdnf基因之慢病毒载体, 并感染大鼠骨髓间质干细胞(Rat mesenchymal stem cells, rMSCs)。运用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型, 经尾静脉注射移植, 对照组注射0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)1 mL, Bdnf-rMSCs和Mock-rMSCs组分别注射Bdnf-rMSCs细胞悬液以及未插入目的基因的空病毒载体感染后的rMSCs细胞悬液各1 mL。各组大鼠分别于术后24 h、移植后2周及2月应用modified Neurological Severity Scores (mNSS)评价神经功能状况。结果显示, 与对照组相比, Mock-rMSCs及Bdnf-rMSCs移植组神经功能改善明显, mNSS评分差异有统计学意义(P<0.001), 而且Bdnf-rMSCs移植组明显优于Mock-rMSCs移植组(P<0.001)。移植后2周及2月, 与对照组相比两移植组梗死区脑组织结构恢复较好, 均可见EGFP阳性细胞在梗死区及其周边区聚集并存活, 并有部分细胞出现神经元样改变。Bdnf- rMSCs移植组中移植细胞大量表达BDNF, 两移植组中均有部分植入细胞表达神经细胞表面标志物。研究表明Bdnf基因修饰的rMSCs经静脉移植后可迁移至脑梗死灶周围, 向神经细胞分化并长期存活。移植后的干细胞可与其分泌的BDNF协同促进脑梗死后神经功能恢复, 这为将来基因工程干细胞移植治疗脑梗死提供了实验依据。     

脊髓性肌萎缩症患者尿液细胞模型的建立

脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy, SMA)大多数在儿童或婴幼儿期发病,表现为进行性、对称性的肢体无力和肌肉萎缩,迄今尚无有效的治疗方法,是婴幼儿最常见的致死性遗传病之一。患者来源的细胞系是该病研究的重要工具,但依赖于肌肉或皮肤活检等创伤性手术的成纤维细胞培养较难被患者及家属接受。文章收集SMA患者及健康对照的新鲜尿液,进行离心、尿液沉渣培养,观察尿液细胞的生长状况,用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析患者尿液细胞中SMN(Survival of motor neuron)蛋白的表达量,应用免疫荧光染色观察SMN蛋白在细胞内的定位。共建立了11例SMA患者和14例健康对照的尿液细胞系,尿液细胞体外增殖旺盛,细胞形态及生长速度较稳定。患者来源的尿液细胞SMN1(Survival of motor neuron 1) 基因缺失突变、SMN蛋白表达量降低,荧光染色提示SMN蛋白在胞浆和胞核中均有定位。尿液细胞培养步骤简单、无创伤性、患儿及其家属的依从性好,是获取和保存病人来源标本的有效方法,在脊髓性肌萎缩症发病机制研究和临床应用方面具有较好的应用价值。