低强度激光生物效应机理研究

结合低强度激光生物效应研究的现状,对低强度激光生物效应机理研究的各种观点进行了归纳分析,提出了对低强度激光生物效应机理研究的一些初步思考,把低强度激光生物效应的一般过程归纳为：激光（辐射)→初始光受体→信号传导与放大→生物效应。并指出探讨低强度激光生物效应机理,应着重于寻找并研究初始光受体与激光的相互作用,以及随后的信号传导与放大过程。     

噬菌体抗体文库的构建及人源抗HIV-1 gp 160抗体的筛选

构建人源噬菌体抗体文库如下：ＨＩＶ感染者脾细胞中提取ｍＲＮＡ,经反转录再以人ＩｇＧ重链Ｆｄ两端及轻链“通用”引物分别扩增Ｆａｂ基因片段,依次插入到噬菌粒载体ｐＣｏｍｂ３中,电转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,经辅助噬菌体救助,重组噬菌体得以溶源裂解,Ｆａｂ表达于噬菌体包膜蛋白Ⅲ的Ｎ端．此噬菌体抗体库的容量为５×１０５．筛选抗ＨＩＶ－１同时又具有能被抗独特型抗体“ＩＦ７”所识别的独特型的阳性抗体：以重组包膜糖蛋白ｇｐ１６０及ｇｐ４１多肽对噬菌体抗体文库进行三次淘选,使抗ｇｐ１６０的特异性抗体得到１００倍的富集．然后通过直接ＥＬＩＳＡ和竞争性ＥＬＩＳＡ实验筛选出两株结合性较好的特异性抗ｇｐ１６０抗体－３Ｂ株与１Ｄ株．直接ＥＬＩＳＡ实验表明这两株克隆均能被“１Ｆ７”所识别,为抗独特型多肽的筛选奠定了基础．     

抗HIV-1 gp160独特型阳性抗体的序列分析及表达

为了确定从噬菌体抗体文库中筛选出的抗体的属性和方便目的基因的表达及其产物的纯化,对两株具有“１Ｆ７”独特型的抗ＨＩＶ－１ｇｐ１６０抗体基因进行了序列分析并构建了可溶性表达载体．发现３Ｂ株含有完整的Ｆａｂ段,１Ｄ株只有重链Ｆｄ段．序列测定表明两株克隆的Ｆｄ段基因完全相同,其可变区ＶＨ属于ＶＨⅠ亚群,而３Ｂ株的“轻链”序列与已知的人的κ和λ轻链无同源性．用从另外的Ｆａｂ抗体文库中筛选出来的３株抗乙肝表面抗原抗体的轻链与３Ｂ的重链重组,并选择一个ＨＩＶ－１ｇｐ１６０特异性较好的重组抗体株,命名为３Ｂｓ．构建了１Ｄ株与３Ｂｓ株的可溶性表达载体,免疫印迹实验证实了具有“１Ｆ７”独特型的抗ｇｐ１６０独特型阳性抗体的表达．     

脉冲Nd:YAG激光对单层KB细胞损伤效应的研究

目的：观察脉冲Nd：YAG激光照射体外单层培养KB细胞后的形态改变及损伤后HSP70,c-Fos的表达情况,初步探讨较强脉冲激光对细胞的损伤效应及损伤修复机制。方法：建立单层培养细胞的脉冲Nd：YAG激光损伤模型,每个脉冲能量密度为160J／cm^2～186J／cm^2或220J／cm^2～257J／cm^2,分别于照后即刻、2h和6h,用台盼蓝染色、TUNEL检测分析该激光对KB细胞的损伤特点,免疫组化法检测HSP70,c-Fos的表达水平。结果：当照射剂量为220J／ecm^2～257J／cm^2时,照后即刻,光斑中央细胞形态严重破坏,直接坏死;周围细胞形态未发生明显改变。2h后周围细胞TUNEL。着色也增强,呈强阳性。照后6h光斑中央及周围细胞着色均减弱。TUNEL着色区直径随时间先扩大后缩小。当照射剂量为160J／cm^2～186J／cm^2时,细胞内HSP70、c-Fos表达随时问先显著增强,而后减弱至正常。结论：脉冲Nd：YAG激光在所选剂量下,可以引起单层KB细胞的损伤,包括即刻坏死、延迟性死亡及可逆性损伤。HSP70、c-Fos的高表达说明它们在保护受损细胞、修复激光所致损伤中发挥重要作用。     

脉冲1.338μm激光角膜损伤效应研究

目的:实验研究脉冲1.338μm激光的角膜损伤效应,确定其损伤阈值,并与10.6μm激光角膜损伤特点进行比较。方法:采用输出波长1.338μm、脉冲宽度5 ms的Nd:YAG激光为照射光源,角膜光斑直径1.7 mm,以不同剂量的激光照射新西兰白兔角膜,于照后1 h观察角膜损伤情况,统计损伤发生率,采用加权概率单位法计算损伤发生率为50%时所对应的激光剂量,即损伤阈值ED50。在1.5倍阈值剂量下比较该激光与10.6μm激光角膜损伤的特点。实验中注意观察晶状体和眼底是否有损伤。结果:脉冲1.338μm激光角膜损伤阈值为27.0 J/cm2(95%置信区间25.8～28.1 J/cm2)。阈值水平下,角膜损伤斑肉眼观察呈淡淡的灰白色,裂隙灯下可见一与角膜同厚的灰白色反光带,晶状体或视网膜正常;1.5倍阈值剂量下,角膜损伤斑为清晰的瓷白色,裂隙灯下可见一与角膜同厚的白色反光带,同时观察到晶状体前表面白色反光点,但视网膜无变化。与之相比,10.6μm激光角膜损伤在裂隙灯下仅观察到一很窄的亮白反光条,位于角膜表层。结论:脉冲1.338μm激光在光斑直径1.7 mm,脉冲宽度5 ms条件下的角膜损伤阈值为27.0 J/cm2。角膜损伤特点是,损伤斑呈灰白色或瓷白色,累及角膜全层,而10.6μm激光损伤仅累及角膜浅层。     

低强度532nm与633nm激光血管内照射生物效应比较

目的：研究同等照射条件的低强度532nm与633nm激光血管内照射对家兔白细胞计数与淋巴细胞凋亡的影响,比较两种激光生物效应的特点。方法：用532nm和633nm激光对健康日本大耳白家兔血管内照射,平均照射功率均设在5mW左右,照射总能量约12J。两组家兔均于照前及照后1d、4d、7d、11d进行外周血白细胞计数,于照前及照后1d、5d进行淋巴细胞凋亡分析。结果：532nm激光照射后,家兔外周血白细胞计数表现为先显著升高后趋向恢复,633nm激光照射后白细胞计数变化类似,但与照前相比升高不明显;与照前相比,两组家免外周血淋巴细胞凋亡比例于照后1d均明显降低,照后5d均显著升高;两组家兔相比,照射后白细胞计数差别明显,但淋巴细胞凋亡比例差异不显著。结论：同等照射条件下,低强度532nm与633nm激光照射血液的生物效应相似,都可以促进白细胞的代谢更新,只是532nm激光的效应略强一些。     

420～750 nm超连续谱光源和532 nm激光致兔视网膜损伤修复

超连续谱(SC)光源是一种宽光谱、高亮度、眼睛危害大的新光源,有关它致视网膜损伤研究却未见报道。为了观察SC光源致视网膜损伤特点和修复过程,试验将波长420～750 nm的SC光源与532 nm激光进行比较,采用两者平行光入射,在0. 1 s照射时间,3 mm角膜光斑直径条件下,用略高于视网膜损伤阈值的功率照射青紫蓝灰兔视网膜;通过检眼镜和HE染色观察视网膜照后4 h,1、3、7、14 d损伤修复过程。SC光源和532 nm激光致视网膜的损伤在检眼镜下为灰色小圆斑。照后4 h出现视网膜外核层固缩深染,感光细胞外节与视网膜色素上皮层(RPE)粘连;随后RPE层色素增生、损伤的外核层细胞丢失,损伤进行性加重; 3 d后色素细胞开始向外核层和内核层迁移,胶质细胞填充损伤区域。由此可见,波长420～750 nm的SC光源主要损伤视网膜外核层和RPE层,后期色素颗粒和胶质细胞填充损伤区域。其视网膜损伤特点和修复过程与532 nm激光类似。     

532nm 激光血管内照射血液实验方法

根据现有的低强度５３２ｎｍ激光器的输出特性,建立了简便、可靠的激光血管内照射血液实验方法。通过选择合适的滤光片,可以确保５３２ｎｍ激光的单纯性;通过分束监视,实现了激光输出功率的准确计量;在实验过程中,根据监视功率值对激光输出功率进行实时调节,可以使其比较稳定地保持在设定附近。该实验方法亦可供其它激光生物效应实验参考。