dsRNA介导的RNA干扰

在多种生物中 ,外源或内源性的双链ＲＮＡ(ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ ,ｄｓＲＮＡ)导入细胞中 ,与ｄｓＲＮＡ同源的ｍＲＮＡ则受到降解 ,因而其相应的基因受到抑制。这种转录后基因沉默 (ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ,ＰＴＧＳ)机制首先在线虫 (Ｃ .ｅｌｅｇａｎｓ)中得以证实。由于这是一种在ＲＮＡ水平的基因表达抑制 ,故也称为ＲＮＡ干扰 (ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒ ｅｎｃｅ) ,简称ＲＮＡｉ[1] 。随后发现 ,在各种生物 ,如果蝇[2 ] 、拟南芥菜[3 ] 、及小鼠[4] 等均存在ｄｓＲＮＡ介导…     

基因沉默：获得性免疫的新途径

基因沉默 (ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ)首先发现于转基因植物。发生沉默的基因可以是外源性转移基因 ,也可以是入侵的病毒或宿主内源性基因。双链ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)作为启动因素或中间体为不同生物基因沉默所共有。通常 ,基因沉默发生在两种水平上 ,一是由于ＤＮＡ甲基化、异染色质化及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默 (ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉ ｌｅｎｃｉｎｇ ,ＴＧＳ) ,另一种是在基因转录后水平上通过对目标ＲＮＡ特异性降解而使基因失活的转录后基因沉默 (ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅ…     

栗菌低毒力dsRNA与协菌病毒dsRNA的序列同源性

以我国栗疫菌（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ（＝Ｅｎｄｏｔｈｉａ）ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）低毒力菌株ＥｐＣ１４０（广西）的（γ－＾３２Ｐ）ＡＴＰ末端标记ｄｓＲＮＡ作探针,与５种真菌病毒ｄｓＲＮＡ进行分子杂交。探针可与紫孢侧耳病毒（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｓａｐｉｄｕｓ ｖｉｒｕｓ）和小麦全蚀菌病毒（Ｇａｅｕｍａｎ－ｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ．ｖｉｒｕｓ）的ｄｓＲＮＡ杂交,但不能与黑曲霉病毒（Ｐｙｒｉｃ     

双链RNA技术在植物病毒研究中的应用

含ＲＮＡ基因组的植物病毒在复制时会产生双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）。本文介绍了用ＣＦ－－１１纤维素粉提取ｄｓＲＮＡ的步骤,并列举了ｄｓＲＮＡ在植物病毒研究中的应用,其主要应用有（１）用于检测植物病毒;（２）用于病毒株系分化;（３）用于病毒卫星ＲＮＡ及亚基因组ＲＮＡ研究;（４）用于侵染性测定及病毒基因组功能研究等。     

栗疫病菌的营养体亲和性基因和dsRNAs对病毒传播的影响

研究了栗疫病菌（Ｃｒｐｈｏｎｅｃｔｒｉａｐａｒａｓｉｔｉｃａ（Ｍｕｒｒ）．Ｂａｒｒ）营养体亲和性基因及ｄｓＲＮＡ病毒对菌株间病毒特征与传播影响,试验选用已知４个ＶＣ基因座位的１５个ＶＣ基因型菌株和３种ｄｓＲＮＡ病毒,通过含病毒菌株与野生型菌株的配对培养,将病毒逐个转入不同ＶＣ基因型菌株,将不同ＶＣ基因型的含病毒菌株与具特定ＶＣ基因差异的野生型菌株配对培养,根据培养两周后野生型菌株培养性状的改变与否     

栗疫菌低毒力dsRNA与真菌病毒dsRNA的序列同源性

以我国栗疫菌［Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ（＝Ｅｎｄｏｔｈｉａ）ｐａｒａｓｉｔｉｃａ］低毒力菌株ＥｐＣ１４０（广西）的［γ─￣３２Ｐ］ＡＴＰ末端标记ｄｓＲＮＡ作探针,与５种真菌病毒ｄｓＲＮＡ进行分子杂交。探针可与紫孢侧耳病毒（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｓｅｐｉｄｕｓｖｉｕｓ）和小麦全蚀菌病毒（Ｇａｅｕｍａｎ─ｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ·ｖｉｒｕｓ）的ｄｓＲＮＡ杂交,但不能与黑曲霉病毒（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｖｉｒｕｓ）、产黄青霉病毒（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｖｉｒｕｓ）和稻瘟菌病毒（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅｖｉｒｕｓ）的ｄｓＲＮＡ杂交。当以低毒力菌株ＥｐＣ３２（云南）作探针时,结果相同。     

RT—PCR检测蓝舌病毒技术的建立

蓝舌病毒 (ＢｌｕｅｔｏｎｇｕｅＶｉｒｕｓ,ＢＴＶ)是呼肠孤病毒科 (Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ)环状病毒属 (Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ)的代表种 ,含10个节段的双链ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)作基因组。其中 ,Ｌ2节段编码ＢＴＶ型特异性抗原ＶＰ2 ,Ｌ3节段和Ｓ7节段编码群特异性抗原多肽ＶＰ3和ＶＰ7。其中 ,ＶＰ7是ＢＴＶ粒子的主要结构多肽之一 ,其编码基因序列保守。ＶＰ7具有高度的抗原性 ,能刺激被感机体产生强的群特异性免疫反应[1] 。蓝舌病毒的易感宿主是牛、羊及野生反刍动物 ,死亡率高达 6 0 %～ 70 %以上 ,并且至今仍无有效的防治措施 ,对畜牧业…     

水稻草矮病毒核衣壳蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达

水稻草状矮化病于70年代曾在南亚、东南亚大面积发生,给当地的水稻生产造成严重损失,在我国也有分布[1]。其病原是水稻草矮病毒(Ｒｉｃｅｇｒａｓｓｙｓｔｕｎｔｖｉｒｕｓ,ＲＧＳＶ),为纤细病毒属(Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ)的一个成员,病毒粒体丝状,由核衣壳蛋白和基因组ＲＮＡ组成[2]。基因组含六个ｓｓＲＮＡ片段,均为双义编码[3,4],其中ＲＮＡ5的毒义互补链编码核衣壳蛋白(ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ,ＮＣＰ)[3]。本文报道应用ＲＴＰＣＲ技术获得ＲＧＳＶ沙县分离株(ＲＧＳＶＳＸ)ＮＣＰ基因的ｃＤＮＡ克隆,并得到其在大肠杆…     

CAR－bacillus菌亚单位核糖核酸RNA限制性内切酶图谱的研究

利用生物体中编码亚单位核糖核酸ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ,ＳＳＵｒＲＮＡ）的ＤＮＡ序列为引物,经ＰＣＲ法扩增到ＣＡＲ－ｂａｃｉｌｌｕｓ的大约１．５ｋｂ的ＳＳＵｒＲＮＡ序列,采用ＨｉｎｄⅡ、ＨｉｎｆⅠ、ＥｃｏＴ１４,ＨａｅⅢ和ｘｈｏⅠ等５种限制性内切酶进行酶切电泳分析,同时比较了来源于小鼠的ＣＢＭ株及来源于大鼠的ＣＢＲ株,未发现两者有差异。     

《RNA编辑：RNA蛋白质编码顺序的变动》

《ＲＮＡ编辑：ＲＮＡ蛋白质编码顺序的变动》《ＲＮＡ编辑：ＲＮＡ蛋白质编码顺序的变动》（ＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ：ｔｈｅａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｃｏｄｉｎｑｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＲＮＡ）由ＲｏｂＢｅｎｎｅ编著,１９ｃｄ年ＥｌｌｉｓＨｏｒｗｏｏ...     

C型产气荚膜梭菌β1毒素基因表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出β1毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI对其进行双酶切处理,回收0．95kb的β1毒素基因片段,最后将其定向克隆在事先经同样内切酶处理的载体pET-28c中相应位点上,转化至受体菌B121(DE3)qh。经BamHI和Eco RI双酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXBl含有B毒素基因,并且具有正确的基因序列和阅读框架。重组菌株BI21(DE3)(pETXB1)经IPIG诱导后,其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达β1毒素蛋白,该蛋白占菌体总蛋白相对含量的12．24％。     

C型产气荚膜梭菌β2毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了0．72kb的β2毒素基因,将纯化的PER产物与载体pGEM—T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／Bam HI和Bam HI／Eco RI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPB2中含有陡毒素基因。随后用Nco I／Bam HI酶切质粒pXCPB2,回收β2毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXB2,经Nco I／Bam HI和Nco I／Hind Ⅲ／Bam HI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有陡毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21（DE3）（pETXB2）表达产物经ELISA检测和SDS—PAGE分析,重组菌株表达的β2毒素蛋白能够被如毒素抗体识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的13．26％。     

玉米矮花叶病毒CP基因dsRNA的原核表达与分离

根据玉米矮花叶病毒CP基因序列设计特异性引物,RT-PCR扩增玉米矮花叶病毒CP基因特异性干涉片段,将干涉片段及pUCCRNAi载体分别用BamH I及Sal I双酶切,然后将干涉片段分别正反向插入pUC- CRNAi载体中,构建CP基因反向重复克隆载体pUCCRNAi+2 F.再利用Pst I-Sal I位点插入到L...     

The use of filamentous phage M13 in protein engineering

M13B1 vector based on the filamentous phage M13 has been constructed. M13B1 phage carries the gene of resistance to ampicillin and contains the unique site of recognition for BamHI restriction endonuclease in gene VIII coding for the major coat protein. BamHI restriction site has been inserted into the gene of the major coat protein by means of oligonucleotide directed mutagenesis. The synthetic DNA fragment coding for the model peptides has been inserted through BamHI site into the M13B1 DNA. The possibility of inserting foreign peptides into the N-terminus at maintaining the viability of hybrid phages has been shown. The differences in specificity of the recombinant phage maturation have been determined by analysing the amino acid sequence of B-protein.     

Hybrid plasmids containing an active thymidine kinase gene of Herpes simplex virus 1.

The gene for the thymidine kinase (TK) of Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is located in the KpnI m and BamHI p fragments of the genome (Wigler et al., Cell 11, 223-232 (1977)). These fragments have been inserted into the EcoRI and BamHI sites, respectively, of plasmid pBR322, and propagated in E.coli. The TK gene contained in the recombinant plasmids was shown to be biologically active when introduced into TK- mouse L cells. Detailed restriction site maps of the BamHI p fragment have been constructed and the approximate location of the TK gene has been determined. Mouse cells transformed with cloned HSV-1 tk+ DNA produced HSV-1-specific thymidine kinase; superinfection with HSV-1 tk- virus increased the level of TK activity tenfold, suggesting that the BamHI p sequences present in transformed cells respond to virus-encoded regulatory gene product(s).     

高效原核表达载体pBV220的改造与应用

以高效原核表达载体 pBV220为骨架载体,应用单链寡核苷酸引物插入法在pBV220多克隆位点的下游插入了六聚组氨酸融合标签编码序列(6×His-Tag)、羟胺和凝血酶蛋白切割位点, 并增加了Xho I和Kpn I酶切位点和强终止密码子TAA, 将此新质粒命名为 pBV223。以此载体表达的目的蛋白在羧基端(C端)带有六聚组氨酸尾以利于通过固定化金属亲和层析快速纯化目的蛋白, 酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将终止密码缺失突变的nm23-H1 cDNA克隆入pBV223载体中, 在大肠杆菌DH5a中成功地表达了Nm23-H1蛋白, 通过镍(Ni)亲和层析一步即简单、快速地得到了纯化蛋白。我们所应用的单链寡核苷酸引物插入直接进行定向克隆的方法是目前为止最简便的方法。     

人HCN2 真核表达载体的构建及在HEK293 细胞中的表达

目的:构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞(HEK293)中的表达情况。方法:对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切(XhoI和BamHI)装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果:测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论:成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。     

细菌表达dsRNA介导的家蚕FTZ-F1基因的RNA干扰

为探索细菌表达目标基因dsRNA介导的RNAi技术是否在家蚕Bombyx mori可行, 本研究引入了在其他物种中广泛应用的细菌表达dsRNA的RNAi系统: HT115细菌株和L4440质粒。利用L4440载体两端含有T7启动子的特点, 设计并构建了针对家蚕核受体FTZ-F1基因的RNA干扰（RNA interference）载体, 将构建好的质粒转入大肠杆菌Escherichia coli HT115, 在IPTG诱导下成功获得目标基因对应双链RNA（dsRNA）。 结果显示: 通过对5龄第7天家蚕幼虫注射IPTG诱导后提取的FTZ F1基因对应的dsRNA 25 μg, 85%的蛹变态发育过程明显延迟, 不能实现幼虫到蛹的形态完全转变。荧光定量PCR分析显示目标基因的表达得到了特异的抑制。实验结果初步表明, 通过细菌表达目标基因dsRNA介导的RNAi策略, 以其经济、高效的特点, 具有广泛应用于家蚕基因功能研究中的潜力。     

乳酸菌启动子——信号肽探测载体pZLB的构建及应用

一般来说,细菌中的蛋白质分泌大致可分为两个途径。一个是管孔途径）（pore pathway）,另一个是普通途径（general pathway）。普通途径依赖于信号肽和SecA将蛋白质输送到周质空间,短暂停留后,经过特异性反应将蛋白质分泌到胞外[1]。