泛肽交联酶（E2）通过苯丙氨酸解氨酶基因启动子参与水稻对紫外光的防护

迄今为止,诱导苯丙类化合物和黄酮类化合物合成并造成类黄酮的积累被认为是植物抵御紫外光的惟一主要的途径。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙类化合物合成的关键酶。通过体内足印试验表明,在pal-1基因启动子中有一段序列CTCCAACAACCCCCTTC可以作为顺式元件参与紫外信号的传递。为了克隆与其相对应的反式因子,我们使用了酵母单杂交体系进行筛选。在鱼饵质粒中,我们将3个拷贝的顺式元件序列串联并与酵母异细胞血红素C(CYC)基本启动子连接。将鱼饵质粒和水稻cDNA表达质粒库共同转化到同一酵母中,通过筛选鉴定,克隆到一些编码泛肽交联酶(E2)基因。氨基酸同源性分析表明,该酶E2(RE2)与其他物种的泛肽交联酶具有很高的同源性。水稻泛肽交联酶受紫外光诱导加速合成。当RE2与水稻核蛋白进行交联反应后能与pal-1基因中顺式元件CTCCAACAACCCCTTC专一结合。从这些结果可以推测水稻泛肽交联酶RE2可能通过苯丙类化合物的合成代谢参与对紫外光的防护。     

筛选dbat启动子顺式元件结合蛋白的酵母单杂交文库的构建

旨在构建酵母单杂交文库用于筛选与dbat基因启动子顺式元件结合的转录因子.首先,分离dbat启动子上的顺式作用元件,并进行3个拷贝的重复后,和报告质粒pHis 2.1连接构建诱饵载体pHis 2.1-dp3.然后,从茉莉酸甲酯诱导的红豆杉细胞中提取总RNA,以纯化出的mRNA为模板,依次完成ss cDNA和ds cDNA的合成,并将纯化的ds cDNA、线性化载体pGADT7-Rec2和诱饵载体pHis 2.1-dp3共转化酵母细胞Y187,各取100 μl分别涂布于SD/-leu和SD/-leu/-trp平板,用于计算重组效率和转化效率,剩余转化液涂布于SD/-leu/-trp/-his/20 mM 3-AT平板,用于筛选阳性克隆.结果表明,重组效率为1.49×106 CFU/μg,共转化效率为1.93×105 CFU/μg;对阳性克隆质粒进行酶切、测序分析,得到6个可编码结合蛋白的基因.以上工作为筛选调控紫杉醇合成关键酶基因dbat表达的转录因子奠定了基础.     

三种酵母启动子在毕赤酵母中的功能比较

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,启动子功能的强弱对于目的基因的表达非常重要.为找到一个启动转录功能较好的启动子,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,在毕赤酵母中研究不同启动子对外源蛋白表达的影响.首先采用PCR扩增的方法克隆了酿酒酵母甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子pScgpd,借助于载体pPIC9K和p...     

水稻胚乳特异性启动子的克隆及序列分析

目的:克隆获得水稻胚乳特异表达启动子pGluB-1。方法:采用PCR方法从水稻"台粳9号"基因组DNA中扩增出pGluB-1启动子序列,并克隆至pMD20-T载体上,酶切鉴定后进行测序并对测序结果进行生物信息学分析。结果:获得大小为1 353bp的pGluB-1启动子序列,该序列与已报道序列的同源性为97%。启动子功能预测及顺式作用元件分析表晨所克隆的启动子序列含有ACGT基序、AACA基序、GCN4基序和醇溶蛋白框等胚乳特异表达必需的调控元件,其序列差异可能是由于不同品种个体差异及多态性的影响。结论:成功克隆出pGluB-1启动子,为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异性表达奠定了实验基础。     

谷子弯孢菌海藻糖酶基因(ClTRE)及其启动子的克隆和序列分析

海藻糖代谢调控真菌生长、发育及致病性,为了进一步研究海藻糖代谢在谷子弯孢病菌中的功能,对海藻糖酶基因及其启动子进行了克隆.根据植物病原真菌海藻糖酶基因的保守序列设计简并引物,扩增得到海藻糖酶基因同源序列.通过RACE技术,首次在谷子弯孢病菌中克隆得到了海藻糖酶基因(ClTRE)全长cDNA序列.序列分析表明,该基因最大开放阅读框为2037 bp,编码679个氨基酸;二级结构预测表明,该蛋白含约40.48％的α螺旋,12.99％的延伸串,6.5％的β转角,40.03％的不规则卷曲;蛋白保守结构域分析发现其含有海藻糖酶特有的保守位点,与其他植物病原真菌中海藻糖酶基因有51％-86％同源性;利用SignalP3.0软件预测谷子弯孢海藻糖酶蛋白具有信号肽.通过染色体步移技术克隆得到其上游启动子序列,利用TFSEARCH软件分析含有多个与逆境胁迫相关的顺式作用元件,初步推测该基因与逆境胁迫相关.谷子弯孢病菌ClTRE基因及其启动子的克隆,为进一步研究该基因在病菌致病中作用以及以该基因为靶位点的化学防控奠定基础.     

水稻EPSP合酶基因的克隆、结构分析和定位

5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶是芳香族氨基酸合成途径中的一个关键酶, 该基因在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值. 根据水稻EPSP合酶基因的EST序列设计探针, 在水稻TAC基因组文库中筛选到16个阳性克隆. 对阳性克隆E11进行亚克隆, 由此获得了由3661核苷酸组成的水稻EPSP合酶基因全序列. 序列分析和同源性比较揭示, 该基因由8个外显子和7个内含子组成. 以窄叶青8号/京系17组合构建的DH群体和分子图谱将水稻EPSP合酶基因定位于水稻第6条染色体的上端.     

香菇顺式调控元件的克隆及其序列分析*

应用顺式调控元件探测载体G221构建了一个香菇Lentinula edodes基因组文库。G221为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体,含有一个由酵母Cyc1基因基本启动子控制的lacZ标记基因,能以转录增强活性筛选香菇DNA片段。用这个基因组文库转化酵母菌,获得了一批lacZ阳性转化子。对其中表达较强的阳性转化子进行质粒抽提和双酶切鉴定,筛选到50个香菇顺式调控元件DNA片段。对其中部分片段进行了测序,并对其中一个序列进行了序列分析,鉴别了该序列上的几个与转录相关的特征序列。该研究也探讨了利用酵母表达系统克隆香菇顺式调控元件的可行性。     

香菇顺式调控元件的克隆及其序列分析

应用顺式调控元件探测载体G221构建了一个香茹Lentinula edodes基因组文库。G221为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体,含有一个由酵母Cycl基因基本启动子控制的lacZ标记基因,能以转录增强活性筛选香茹DNA片段。用这个基因组文库转化酵母菌,获得了一批lacZ阳性转化子。对其中表达较强的阳性转化子进行质粒抽提和双酶切鉴定,筛选到50个香茹顺式调控元件DNA片段。对其中部分片段进行了测序,并对其中一个序列进行了序列分析,鉴别了该序列上的几个与转录相关的特征序列。该研究也探讨了利用酵母表达系统克隆香茹顺式调控元件的可行性。     

以酵母单杂交体系克隆水稻RAPB基因cDNA及其序列测定

在一些真核基因的 5′上游区中存在核心序列为CCAAT的顺式元件 ,CCAAT结合蛋白以异源多聚体的方式结合于该顺式元件并行使转录调控功能 .CCAAT结合复合物至少存在 3个不同的亚基 ,且结合复合物的单个亚基都不具备DNA结合活性 .首次报道以酵母单杂交体系筛选方法 ,结合酵母功能互补法鉴定 ,从水稻中克隆了定名为RAPB的cDNA ,它编码与酵母CCAAT结合复合物中HAP2亚基具类似功能的蛋白 .RAPB蛋白的C端同样存在与HAP2功能域高度保守的区域 ,但其N端与其他HAP2类似蛋白间无明显的顺序同源性 ,且不存在谷氨酰胺丰富区 .根据Southern杂交结果推测 ,在水稻 (OrizasativaL .)基因组中仅存在一个拷贝的RAPB基因 .     

水稻淀粉分支酶基因5′上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻淀粉分支酶基因 (sbe1) 5′上游调控区中存在的顺式作用元件 ,我们将水稻sbe1基因翻译起始点 (ATG) 5′上游区 1.2kb(- 10 96～ 74bp)片段经过不同限制性内切酶消化及外切核酸酶ExoIII部分消化 ,得到 4个 5′端缺失的片段。将这些缺失片段分别与 gus基因编码区连接 ,构建成融合质粒 ,经土壤农杆菌 (Agrobacterium)介导引入水稻 ,定量测定转基因水稻植株未成熟种子中的 gus酶活力。结果表明 ,- 5 16～ 6 4bp的sbe1启动子片段可以驱动gus基因的高表达 ,其它 3个启动子片段 (- 10 96～ 74bp ,- 2 95～ 74bp ,- 146～ 6 4bp)驱动 gus基因表达的能力较低。推测在sbe1基因 5′上游区 - 5 16～ - 2 95bp片段中可能存在能使 gus基因高表达的增强元件     

Phenylpropanoid compounds in primary leaf tissues of rye (Secale cereale). Light response of their metabolism and the possible role in UV-B protection

The present study was undertaken in order to investigate the suitability of certain markers for UV plant response. In addition, we attempted to link the internal tissue distribution of specific UV-absorbing compounds to profiles of radiation gradients within intact primary rye leaves ( Secale cereale L. cv. Kustro). Etiolated rye seedlings irradiated with low visible light (LL) and/or UV radiation were used to study enzyme activities of the two key enzymes, phenylalanine ammonia-lyase (PAL) and chalcone synthase (CHS), together with the tissue-specific accumulation of soluble phenylpropanoid products. Plants grown under relatively high visible light (HL) with or without supplementary UV-B radiation were used for further characterization. Apparent quantum yield and fluorescence quenching parameters were monitored to assess potential physiological changes due to UV-B exposure in HL-grown seedlings. A quartz fibreoptic microprobe was used to characterize the internal UV-B gradient of the leaf. The response of the phenylpropanoid metabolism to UV radiation was similar in primary leaves of both etiolated and HL-treated green plants. The epidermis-specific flavonoids together with CHS activity turned out to be suitable markers for assessing the effect of UV on the phenolic metabolism. The functional role of phenylpropanoid compounds was strongly implicated in protecting rye from UV-B radiation.     

Evidence for cooperativity between E2 binding sites in E2 trans-regulation of bovine papillomavirus type 1.

The long control region of bovine papillomavirus type 1 (BPV-1) can function in an orientation- and position-independent manner as an E2-dependent enhancer. Dissection of the long control region has revealed two E2-responsive elements, E2RE1 and E2RE2, which map, respectively, between nucleotides 7611 and 7806 and between nucleotides 7200 and 7386 of the BPV-1 genome. In this study, we have carried out a detailed analysis of E2RE1, which has previously been shown to be involved in the regulation of the BPV-1 promoters P89 and P7940. One characteristic of E2RE1 is the presence of a pair of ACCN6GGT motifs (E2 binding sites) at each end of the element. To determine the contribution of these sites, as well as other sequences within E2RE1, to enhancer function, specific mutations and deletions were generated by oligonucleotide reconstruction. The functional analysis of these mutations confirmed that a pair of E2 binding sites was essential for E2-dependent enhancer activity but also indicated that cooperativity between the motifs at each end of E2RE1 creates a highly responsive element. Isolated ACCN6GGT motif pairs could also act as E2-dependent enhancers but at a significantly reduced level in comparison to the intact element. The sequences between the E2 binding sites in E2RE1 were not required for enhancer function and could actually block the enhancer activity of an isolated pair of E2 binding sites when positioned between the binding sites and the enhancer-deleted simian virus 40 early promoter.