活细胞内以光漂白荧光损失(FLIP)技术分析HuR蛋白的应激动力学行为 |
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引用本文: | 高星杰,张毅,付雪,苏超,张春燕,张桂敏,尹洁,王鑫廷,姚智,杨洁.活细胞内以光漂白荧光损失(FLIP)技术分析HuR蛋白的应激动力学行为[J].中国细胞生物学学报,2014(9). |
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作者姓名: | 高星杰 张毅 付雪 苏超 张春燕 张桂敏 尹洁 王鑫廷 姚智 杨洁 |
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作者单位: | 天津医科大学基础医学研究中心;天津医科大学药学院;天津医科大学基础医学院; |
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基金项目: | 国家杰出青年科学基金(批准号:31125012);国家自然科学基金(批准号:21305103、31100967、31170830、31370749);教育部“创新团队发展计划”(批准号:IRT13085);中国博士后科学基金(批准号:2013T60258)资助的课题~~ |
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摘 要: | 人类抗原R(human antigen R,HuR)是一种多功能RNA结合蛋白,参与细胞应激颗粒(stress granules,SGs)的构成。SGs是细胞在受到外界环境刺激时在胞浆中形成的颗粒状结构。该研究是利用光漂白荧光损失(fl uorescence loss in photobleaching,FLIP)技术对活细胞内的HuR蛋白颗粒进行应激动力学分析。首先,利用脂质体将RFP-HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,以Western blot和细胞免疫荧光实验确定是否实现对于HuR蛋白的红色荧光蛋白(red fl uorecent protein,RFP)标记;然后以405 nm激光束脉冲式重复光漂白HuR应激颗粒,分别监测同一漂白细胞内的其他HuR颗粒以及核内荧光信号,并以邻近的未漂白细胞作为对照组。实验结果表明,转染重组质粒后可有效表达RFP-HuR融合蛋白,且与SGs标记蛋白G3BP存在共定位关系。在第一个光漂白循环,漂白区荧光密度便从2 500 a.u.降低至0 a.u.;而经过约12个漂白循环(240 s)后,邻近HuR颗粒的荧光密度从漂白前的1 800 a.u.左右降低并维持在200 a.u.左右,表明活细胞内的HuR颗粒呈现高度的动态性;而胞核区荧光密度亦从4 400 a.u.降低至2 000 a.u.左右,表明HuR蛋白是一种核浆穿梭蛋白,在SGs、胞浆及胞核之间存在一定的动态平衡。利用FLIP技术可以分析并比较SGs不同成分的应激动力学属性,有助于进行SGs相关临床疾病的分子机制探讨。
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关 键 词: | HuR蛋白 光漂白荧光损失 应激颗粒 活细胞 荧光标记 |
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