乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1 203bp.克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型.有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点.然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal I线性化的pPIC9K-preS质粒用电击法导入巴斯德-毕赤酵母GS115His-中.通过MD-G418平板筛选和5'AOX1和3'AOX1引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长preS基因的His+Mut+酵母工程菌株.此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长PreS蛋白并可分泌到培养液中,SDS-PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的PreS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应.     

乙型肝炎病毒PreS2S基因在毕赤酵母中表达的研究

构建重组质粒PHIL-D2/PreS2S以研究乙肝病毒PreS2(120-146)S基因编码蛋白在毕赤酵母中的表达。通过PCR扩增获得PreS2S片段,插入含AOX1启动子的Pichia Pastoris表达载体PHIL-D2中,构建重组表达质粒PHIL-D2/PreS2S,转化酵母宿主菌GS115。挑取阳性克隆摇床培养,甲醇诱导表达。通过ELISA、RPHA鉴定表达产物。成功构建了PHIL-D2/PreS2S真核表达载体,经过序列分析,插入的基因为在中国流行的adr亚型。在毕赤酵母中重组载体表达了S蛋白,S蛋白的表达量为34.9 mg/L,PreS2抗原检测为强阳性。利用毕赤酵母表达系统能够有效地表达乙型肝炎病毒的PreS2S蛋白,PreS2S蛋白具有良好的生物学活性。     

乙型肝炎病毒包膜M蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

转化了乙肝病毒 preS2 S基因的重组巴斯德毕赤酵母菌株经甘油培养基充分增殖 ,然后转移到甲醇培养基中进行诱导表达。破碎细胞并提取胞内蛋白 ,经ELISA和WesternBlot检测 ,证明有 4株GS1 1 5 /HIS MUT 表达了HBVM蛋白。     

乙型肝炎病毒包膜M蛋白在巴斯德毕德毕赤酵母中的表达

转化了乙肝病毒ｐｒｅＳ２－２基因的重组巴斯德毕赤酵母菌株经甘油培养基充分增殖,然后转移到甲醇培养基中进行诱导表达,破碎细胞并提胞内蛋白,经ＥＬＩＳＡ和ＷｅｓｔｅｎＢｌｏｔ检测证明有４株ＧＳ１１５／ＨＩ＾＋ＭＵＴ＾＋表达了ＨＢＶ Ｍ蛋白。     

乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2 S基因在PichiaPastor妇酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2 S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞：KM71,G418筛选多拷贝整合克隆。经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS—PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高, 表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYME MONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg／100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2 S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白,为探讨HBVX蛋白与慢性乙型肝炎及肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法：用PCR方法扩增X基因序列,并分别在上下游引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,插入pPICZαA载体,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切及测序鉴定,构建HBVX蛋白毕赤酵母表达质粒pPICZαA-HBx;电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和465bp的片段,表明目的片段已插入载体中,序列测定表明其含有完整的X基因片段,Western blotting结果显示含有pPICZαA-HBx的毕赤酵母GS115能分泌表达X蛋白。结论：构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-HBx,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达X蛋白。     

带有PreS的重组乙肝表面抗原在毕赤酵母中的表达

带有ＰｒｅＳ区的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）有望成为新一代更高效的乙肝疫苗。利用毕赤属酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达系统,表达了带有ＰｒｅＳ区免疫决定簇的理组乙肝表面抗原Ｓ１Ｓ、ＳＳ１和Ｓ２Ｓ。对表达产物的性质鉴定表明,产物可以形成２具有相应的Ｓ、ＰｒｅＳ１或ＰｒｅＳ２抗原性的颗粒,表达水平高于啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）表达系统。     

乙型肝炎病毒表面抗原在乳酸克鲁维酵母中的表达

将乙型肝炎表面抗原基因插入具调控型启动子PH05的乳酸克鲁维酵母表达载体中,构建完成质粒pLSl．转化宿主菌Kluyveromyces lactis CXJ1—7A,ELISA结果表明．其表达水平受无机磷浓度的调控。为了进一步提高表达水平,我们将Pls1中的乙型肝炎表面抗原表达单元插入带完整Pkd1序列的载体Pe1,并将构建成的质粒Pls2转化MW98—8C。在比较了CXJ-7A／Pls1和MW98—8c／Pls2后,我们发现MW98—8c／Pls2的稳定性大大提高．表达量也增加4～8倍。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的比较

为获得丙型肝炎病毒的核心蛋白（Core）,将克隆有Core基因的表达载体pBVIL1-Core转化大肠杆菌HB101,温度诱导表达Core蛋白。同时利用PCR方法以含有丙型肝炎病毒全基因的质粒PBR^TM／HCV为模板扩增Core基因,克隆进表达载体pPICZαA,构建表达载体pPICZαA-Core,转化毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,在甲醇诱导下表达Core蛋白。Western-blot显示Core蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白量占菌体总蛋白的20％;在酵母培养上清中存在Core蛋白,证明Core蛋白在酵母系统中成功表达。     

毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用

巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统作为一个日臻完善的外源蛋白真核表达系统由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的优势而得到越来越广泛的应用。分别从该表达系统的优点、外源基因整合及调控机理、表达蛋白糖基化及翻译后修饰等方面综述了其在外源蛋白表达中的研究进展及应用。     

平菇漆酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

采用RTPCR技术克隆到一个平菇(Pleurotusostreatus)漆酶基因的全长cDNA,命名为lccPo1,其序列提交GenBank,登录号为AY450404。将其ORF克隆到毕赤酵母表达载体pHBM906,转化3株毕赤酵母GS115、KM71和SMD1168,该漆酶基因在3种毕赤酵母菌株中均实现了分泌表达。3种摇瓶培养条件①25℃,1.0%(VV)甲醇;②20℃,1.0%(VV)甲醇;③20℃,0.5%(VV)甲醇,进行比较研究后发现适当提高甲醇浓度有利于漆酶在低温条件下表达,而降低培养温度到20℃则可以提高漆酶的产量2～6倍。3株重组毕赤酵母在其最适反应条件下测得三者粗酶液最高漆酶酶活分别为3.19UmL[GS115(pHBM565)]、2.56UmL[KM71(pHBM565)]和2.49UmL[SMD1168(pHBM565)]。对重组酶进行相关的酶学性质分析表明,三者的最适反应pH值约为4.2,最适反应温度约为60℃。重组毕赤酵母GS115(pHBM565)所产酶的热稳定性稍好,在pH稳定性方面三者没有太大差异。     

金针菇漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究

综合运用cDNA末端快速扩增 (RapidAmplificationofcDNAEnds ,RACE )和基因组步行等技术克隆到一个金针菇 (Flammulinavelutipes)的漆酶结构基因和其对应的全长cDNA ,经测序和BLAST比对分析表明该基因属于多铜氧化酶基因家族 ,与已发表的漆酶基因 (AF176 2 30 )的同源性最高 ,在氨基酸水平为 72 %。该结构基因命名为gl ccFv,cDNA命名为lccFv ,其序列提交GenBank ,登录号分别为AY4 85 82 6和AY4 5 0 4 0 6。将lccFv的开放阅读框克隆到毕赤酵母表达载体pHBM90 6 ,转化毕赤酵母GS115且实现了分泌表达。将重组毕赤酵母GS115 (pHBM5 6 5 )诱导产酶 ,在培养温度 2 0℃、甲醇流加量为 1 0 % (V V)的情况下 ,其分泌表达的LCCFv的最高酶活为 0 10 70U mL ,最适反应温度为 4 5℃ ,最适反应pH值为 3 9,在最适反应条件下其热稳定性和pH值稳定性均较好     

同时利用AOX1和GAP启动子表达SAM合成酶促进重组毕赤酵母中S-腺苷甲硫氨酸积累

利用重组毕赤酵母(Richia pastoris)强化表达S-腺苷甲硫氨酸(S-adenvylmethionine,SAM)合成酶(SAM synthetase,SAMS),发酵生产SAM时,胞内SAMS活性和ATP水平是影响SAM合成的重要因素.为了同时保持较高的SAMS活性和ATP供应,我们构建了一株既含有AOX1诱导型表达单元,又含有GAP组成型表达单元的双SAMS表达单元P.pastoris重组菌株Gd.它既能受甲醇调控表达SAMS,又能以甘油为碳源表达SAMS.在培养过程中,先是以甲醇诱导SAMS表达,得到较高的酶活,然后在发酵中后期再将碳源换为甘油.这样不但可以维持较高的酶活,而且可以提高胞内ATP含量.实验结果显示,对于同时利用AOX1和GAP启动子表达SAMS的重组菌,可采取甲醇和甘油两阶段补料,该重组菌的SAMS比产率高于组成型重组茵Xg,Gd进入甘油补料期后胞内ATP含量高于诱导型重组菌Ga.双表达单元菌株Gd的SAM产量达到1.41 g/L,比诱导型表达SAMS的重组菌株提高了76.3%,比组成型表达SAMS的重组菌株提高了60.2%,.     

按酵母基因优化的HPV6型L1蛋白在大肠杆菌中高效表达

人乳头瘤病毒6型(human papillomavirus type 6,HPV6)是尖锐湿疣的主要病因,该病的发病率近年来持续上升,是仅次于淋病的第二位性病,并且其病情顽固,易复发,治疗困难.而尖锐湿疣与HPV6感染之间是单一的因果关系,这为用疫苗预防提供了可能.实际上HPV(如16、18、6、11等型别)L1的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗正在进行Ⅱ期临床试验,前景看好[1].但是现在普遍采用昆虫细胞培养系统,价格昂贵.为降低成本,同时尝试了真核表达系统甲醇营养型酵母(Pichiapastoris)和原核表达系统大肠杆菌(E.coli)两种表达系统.按照Pichia酵母的密码偏爱性重新合成HPV6-L1基因,结果在该系统仅有少量表达[2].但是发现该合成基因在E.coli中能够高效表达,而目前文献报道的HPV L1蛋白多以融合方式(与GST)在E.coli中少量表达[3].现将工作结果报道如下,并对影响蛋白表达的可能因素作简要探讨.     

人血管内皮生长因子（VEGF165）在毕氏酵母中的表达及生物活性分析

采用PCR扩增hVEGF165基因,经DNA序列分析后,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichi a pastoris酵母表达载体中,构建重组质粒pPIC9K/hVEGF165,经转化酶母宿主菌KM71,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,1％甲醇诱导表达。 表达产物在Heparin-Sepharose CL6B亲和层析经后,以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）测定其生物学活性。SDS－PAGE分析显示,表达产物以可溶性分子形式存在上清中,诱导4天的表达量达上清总蛋白质的60％以上。Western印迹表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Heparin-SepharoseCL6B亲和层析纯化,rhVEGF165的纯度可达到90％以上。体内、外生物学活性研究证实其具有刺激HUVEC增殖和促进肢体缺血性动物模型侧枝循环建立的功能。     

aiiA基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

构建携带N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiA)的重组毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-aiiA,采用电转化方法转入毕赤酵母GS115,经营养缺陷型培养基、表型鉴定和高G418浓度筛选获得高拷贝表达盒的酵母转化子,用0.5%甲醇诱导表达,RT-PCR鉴定可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,aiiA基因在毕赤酵母中成功表达,用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有降解N-酰基高丝氨酸内酯的活性。     

以甘油为碳源发酵Pichia pastoris组成型表达人血管生成抑制素

在Pichia pastoris组成型表达外源蛋白中碳源起着重要的调控作用。分别以葡萄糖、甘油、甲醇和油酸为碳源研究它们对摇瓶发酵GS115(pGAP9K-AS)表达hAS的影响。结果如下:油酸(163mg/L),甘油(83mg/L),葡萄糖(76mg/L),甲醇(57mg/L)。根据以上结果,以甘油为碳源在30L生物反应器中进行GS115(pGAP9K-AS)工程菌的高密度发酵。48h后测得hAS的产量为169mg/L。产物hAS具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的CAM血管生成和实验小鼠黑色素瘤的生长。治疗12d后,抑瘤率达到90%,统计学分析结果表明hAS治疗组和PBS治疗组小鼠的肿瘤体积呈现显著性差异(P<0.01)。     

杂合抗菌肽CecA-Mag的人工合成及其在Pichia pastoris中的分泌表达

根据抗菌肽天蚕素A(cecropinA,CA)N端第1~7个氨基酸残基,马盖宁(magainin,M)N端第2~12个氨基酸残基,以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成了杂合肽CA(1~7)-M(2~12)基因,同载体pPICZα-A连接后转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子量约1.9kDa的CecA-Mag杂合抗菌肽获得表达,抗菌特性研究表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,对多数G-菌及G 菌均有较好的抑菌活性。初步抑菌活性测定,显示该杂合肽对金黄色葡萄球菌、耐氨苄青霉素的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌有良好的抑杀活性。酸稳定实验显示pH为3.2时仍具有相当高的活性。热稳定性实验显示该杂合肽100℃加热5min后仍具有抑菌活性。这些特点使得重组抗菌肽CecA-mag在疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。