人巨细胞病毒糖蛋白52kD抗原编码区段在大肠杆菌中高效表达

采用聚合酶链反应,从人巨细胞病毒重组质粒克隆pBH中扩增并分离了含糖蛋白52kD抗原编码区段;扩增产物经纯化和EcoR Ⅰ酶切后,与相同酶切的高效表达质粒pBV-220重组,构成含人巨细胞病毒糖蛋白52kD抗原编码区段的高效表达质粒pHcMV 52;用此重组表达质粒转化大肠杆菌JM101,经增殖和42℃温度诱导以及筛选。阳性克隆经12.5％SDS-PAGE表明,外源基因表达蛋白质量占菌体溶解液中蛋白质总量20％。蛋白质印迹(western blot)杂交证实该表达产物具有免疫原性。     

多巴胺合成相关酶基因联合治疗帕金森病大鼠模型的研究

目的 利用骨髓间充质干细胞（MSCs）作为运载细胞,携带DA合成代谢过程中3个重要相关酶的基因：酪氨酸羟化酶（TH）、芳香族氨基酸脱羧酶(AADC) 和三磷酸鸟苷酸环化水解酶-I (GCH-I)基因,治疗帕金森病(PD) 模型大鼠。方法 首先用重组病毒AAV-TH、AAV-AADC 和AAV-GCH-I的上清液对MSCs进行体外感染;将携带有TH、AADC和GCH-I基因的MSCs移植到PD模型大鼠纹状体内,检测纹状体及黑质内多巴胺及其代谢产物的变化,并观察其行为学的变化,以评估上述基因对PD大鼠的治疗作用。结果 重组假病毒颗粒感染MSCs后植入PD模型大鼠损伤侧纹状体内。通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 和原位杂交的方法在移植后12w仍能检测到上述三种基因的表达。免疫荧光检测发现移植后12w MSCs在脑内存活良好;移植后4w、8w、12w行为学观察发现阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为较对照组LacZ基因移植组有明显改善（p<0.01）;移植后12w时三重基因移植组较双重基因移植组有明显改善（p<0.01）。移植后12w用高效液相色谱（HPLC）电化学法测定损伤侧纹状体和黑质内DA及其代谢产物3,4-二羟苯丙酸（DOPAC）的含量,三重基因移植组较hTH+hGCH-I基因移植组有明显增高（p<0.01）;三重基因移植组较hTH+hAADC基因移植组有所增高,但两组之间没有显著性差异。结论 基因工程改造的MSCs 在移植到PD模型大鼠脑内后可以很好地表达目的基因并在对动物行为学及生化方面改善的长期观察中发现三重基因联合脑内移植可能是比双重基因联合移植更佳的帕金森病基因治疗途径。