七鳃鳗myd88基因的生物学特性及其下游分子的表达模式分析

髓样分化因子88 (Myeloid differentiation factor 88, MYD88)是Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)信号通路的关键接头分子, 在先天性免疫和适应性免疫中都起到重要作用。为了揭示七鳃鳗Myd88的生物学功能, 研究首次从七鳃鳗(Lampetra japonica)中克隆了myd88基因, 其ORF为852 bp, 共编码283个氨基酸, 推测的分子量为32.432 kD, 等电点为6.25, 无信号肽。多重序列比对表明七鳃鳗Myd88的氨基酸序列与其他物种同源性较高, 具有高度保守的N端死亡结构域和C端的TIR结构域的Box1、Box2和Box3基序。实时荧光定量PCR分析表明: myd88基因在七鳃鳗各组织中均有低水平转录表达, 鳃中表达量最高, 其次是肌肉、髓和肾。脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后, 七鳃鳗myd88在白细胞中表达量升高最显著, 其次是在鳃中的表达量也明显升高, 表明七鳃鳗Myd88参与七鳃鳗的抗菌免疫过程。此外, LPS刺激七鳃鳗还能诱导TLR信号通路Myd88依赖途径的下游信号分子Irak1、Traf6、Ikkβ和Nfkb在各组织中的转录表达。研究结果表明七鳃鳗中可能存在TLR/Myd88信号通路, 为进一步探究该信号通路参与免疫应答的起源与进化奠定了基础。     

尼罗罗非鱼traf6基因表达谱及信号转导

肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是一种重要的接头蛋白,在Toll样受体/白细胞介素-1受体(TLR/IL-1R)超家族所触发的信号通路中起重要作用,与先天性免疫密切相关。文章研究了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)traf6的表达模式和初步的功能。在健康鱼中,traf6转录本广泛表达于所有受检组织中,在血液中表达水平最高,在肝脏中最低。在不同的胚胎发育阶段也检测到traf6的表达。在无乳链球菌体内感染后,大多数受检组织中traf6 mRNA的表达量上调。此外,LPS、Poly I:C和S.agalactiae可显著诱导尼罗罗非鱼巨噬细胞traf6的表达。此外,在HEK293T细胞中过表达表明,TRAF6分布于细胞质中,可显著提高NF-κB的活性。免疫共沉淀(Co-IP)实验表明,TRAF6可与IRAK1(白细胞介素-1受体相关激酶1)相互作用,IRAK1在TLR/IL-1R信号通路中也起重要作用。在体内,TLR2、TLR21和TLR13b的过表达可上调traf6 mRNA的表达水平,表明TRAF6参与了TLR2、TLR21和TLR13b介导的信号转导,提示TRAF6在病原体入侵的免疫应答中起重要作用。     

罗非鱼TRAF3基因的表达及功能研究

肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关因子3(TRAF3)是多种免疫途径中的关键调控因子。从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中克隆获得了TRAF3基因, 命名为OnTRAF3(GeneBank No. MN258118), 该基因包含1个环指结构域、1个锌指结构域、1个卷曲螺旋和MATH结构域。多序列比对表明, OnTRAF3与其他已知的TRAF3蛋白具有高度的相似性, 尤其是MATH结构域。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示, OnTRAF3在各组织中广泛分布, 且在脑、皮肤、肠和鳃中表达量较高。在无乳链球菌诱导后, 多个组织中的OnTRAF3表达量出现了不同程度的上调, 说明OnTRAF3参与了罗非鱼的抗菌免疫应答。亚细胞定位实验显示, OnTRAF3分布在HEK293的细胞质和细胞核中。此外, 荧光素酶报告基因实验结果显示, 野生型(WT)OnTRAF3可显著激活NF-κB信号, 而coiled-coil和MATH 结构域缺失后, 依然能够显著激活NF-κB 活性, 而RING 和Zinc缺失后, 该激活作用则明显减弱, 表明RING 和Zinc 结构域是OnTRAF3在免疫信号通路中行使功能的关键结构域。研究为探索TRAF3在罗非鱼免疫应答中的功能提供了重要的基础。     

斑马鱼notch3基因真核表达载体的构建及其表达分析

为了进一步研究notch3基因在斑马鱼中的功能,构建了斑马鱼notch3真核表达载体并在真核细胞中成功表达.其中斑马鱼notch3基因编码序列(coding sequence,CDS)从NCBI的在线数据库中获得,根据序列克隆其胞内段(notch intracellular domain,NICD),接着利用同源重组技...     

斑马鱼TANK基因的克隆及功能初探

哺乳动物中, TRAF家族相关的NF-κB激活因子(TRAF family member-associated NF-κB activator, TANK)参与调控核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)信号通路,在硬骨鱼中,最新研究表明TANK在青鱼抗病毒天然免疫反应中具有重要的功能,但在模式动物斑马鱼(Danio rerio)中还没有有关TANK的报道。本研究率先在斑马鱼开展TANK功能研究,克隆并获得了斑马鱼TANK基因(Danio rerio TANK, DrTANK),其编码区(coding sequence, CDS)包括1 047个核苷酸,编码349个氨基酸。免疫印迹实验显示Dr TANK蛋白大小约50 kD;免疫荧光实验证明Dr TANK主要定位于细胞质中,表明其为一种胞质蛋白;双荧光素酶报告基因研究结果显示,在EPC细胞中,过表达Dr TANK并不能显著上调干扰素启动子的表达,但聚肌胞苷酸[poly (I:C)]和草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)的刺激能显著增强其诱导干扰素启动子的表达活性。本研究结果表明Dr TANK在斑马鱼抗病毒天然免疫反应中可能具有重要作用,为后续Dr TANK功能研究奠定了基础。     

肿瘤坏死因子受体作用因子3(TRAF3)结构及生物学功能

目前在哺乳动物中发现6个肿瘤坏死因子受体作用因子(TNF receptor associated factors,TRAFs)家族成员,它们主要参与TNF受体家族信号通路.这些TRAF成员在C末端有螺旋卷曲结构和保守的TRAF结构域.TRAF3是TRAF家族中功能最为多样化的成员之一.1996年对TRAF3基因敲除小鼠进行研究发现,小鼠在出生早期死亡,这阻碍了TRAF3的生物学功能进一步研究,另一方面也证实了TRAF3在出生后发育以及维持正常的免疫系统功能方面有着重要生物学功能.10年后研究发现,TRAF3的缺失能够导致非经典NF-κB信号通路激活,这使得TRAF3在该信号通路中的功能得到了进一步的阐述.最近研究表明,TRAF3不仅能够负向调节NF-κB和MAPK信号通路,还能够正向调节Ⅰ型干扰素的产生.通过研究还发现,TRAF3可能存在着负向调节钙调蛋白磷酸酶活性的新功能.因此,研究TRAF3在免疫信号通路中的作用以及与之相关的病毒疾病具有重要的意义.     

关岭牛MyoD基因CDS区的克隆、序列分析及其真核表达载体构建

[目的]通过关岭牛MyoD基因CDS区的克隆、序列分析及pcDNA3.1(+)-MyoD真核表达载体的构建,为后续研究MyoD基因的调控机制奠定基础。[方法]通过设计特异性引物克隆关岭牛MyoD基因的CDS区,并用DNAStar、Ex PASy等软件对该基因CDS区进行序列分析;同时利用双酶切的方法构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-MyoD。[结果]关岭牛MyoD基因的CDS区全长957bp,编码318个氨基酸;其编码的蛋白属于亲水性蛋白,蛋白二级结构主要以α-螺旋及无规则卷曲为主,含有b HLH结构域,无明显的跨膜区域。同源性分析显示,关岭牛MyoD基因的CDS区序列与海福特牛和山羊的同源性最高,核苷酸同源性为98.96%和96.9%,氨基酸同源性为100%和89.3%。MyoD蛋白的氨基酸肽链长度由低等动物到高等动物有逐渐加长的趋势。[结论]成功克隆了关岭牛MyoD基因的CDS区,并构建了其真核表达载体pcDNA3.1(+)-MyoD,为进一步研究MyoD基因在成肌分化过程中的作用及其调控机制奠定基础。     

泛素化在TRAF2介导的NF-κB信号通路中的作用

NF-κB（核因子κ增强子结合蛋白）是核转录因子家族成员,具有调节免疫、炎症和细胞存活的功能.它可被TRAF2（tumor necrosis factor receptor associated factor 2,肿瘤坏死因子受体相关因子2）等相关因子活化.TRAF2包含了N-端的环指结构域和C-端的高度保守结构域.它通过与肿瘤坏死因子受体超家族成员相互作用,介导了下游信号通路.而TRAF2的泛素化在过程中是关键的,鞘磷脂作为TRAF2的泛素化连接酶辅助因子,在TRAF2介导的NF-κB信号通路中发挥重要作用.     

杂交鳢TRAF2基因克隆、组织分布及对病原菌感染的应答分析

肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)是一种重要的胞内信号接头蛋白,参与激活NF-κB和MAPK信号通路,在免疫防御、炎症反应和细胞凋亡等过程发挥关键作用.为了探索杂交鳢(Channa maculate ♀ x Channa argus ♂)TRAF2功能及其对两种病原菌感染的应答机制,本研究克隆获得杂交鳢TRAF2(命名为CmaTRAF2)基因的完整开放阅读框(ORF),长度为1 566 bp,预测编码521个氨基酸,与龟壳攀鲈(Anabas testudineus)、杜氏鰤(Seriola dumerili)TRAF2蛋白序列相似性最高,都达到91％.与其他TRAF2相似,CmaTRAF2具有一个RING结构域、一个锌指结构域、一个TRAF结构域.系统发育分析表明CmaTRAF2与其他硬骨鱼类TRAF2聚为一支,其中与龟壳攀鲈TRAF2的亲缘性关系最近.实时荧光定量PCR检测分析显示CmaTRAF2在健康杂交鳢所检测的9种组织中广泛分布,其中脾脏中表达量最高,头肾中的表达量次之,肝脏中的表达量最低.采用鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)腹腔注射感染杂交鳢后,肝脏、脾脏和头肾中CmaTRAF2的表达在感染后不同时间点总体呈现为上调趋势,且分别在10h、l d和2d时达到最大值(P＜0.05).舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)注射感染杂交鳢后,CmaTRAF2的表达变化相似,也主要呈现上调趋势,且分别在肝脏、脾脏和头肾中于12 h、5 d和2 d时达到峰值(P＜0.05).以上结果表明,CmaTRAF2参与了杂交鳢抵御鰤诺卡氏菌和舒伯特气单胞菌感染的免疫应答反应.本研究可为进一步探索鱼类TRAF2的免疫防御和信号转导机制提供基础资料.     

TRAF6 与NF-κB 在特发性炎症性肌病小鼠肌肉中的表达及意义

目的:研究肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)与核转录因子κB(NF-κB)在特发性炎症性肌病(IIMs)中的表达情况,探讨TRAF6在IIMs发病中的作用及机制。方法:30只雌性BALB/c小鼠随机分为5组(每组6只),A:正常对照组;B~E:IIMs模型自第一次免疫后分别在1周、2周、3周、4周末处理组;采用实时荧光定量PCR方法检测各组小鼠肌肉组织中TRAF6与NF-κB m RNA表达水平。结果:(1)IIMs各组小鼠肌肉中TRAF6与NF-κB m RNA与正常对照组相比表达均有不同程度升高(P0.01),第2周末时升高最为显著(P0.01),第3周、4周呈下降趋势(P0.01);(2)IIMs小鼠各组肌肉组织中TRAF6与NF-κB m RNA表达水平与肌肉炎症程度呈正相关(r=0.940,r=0.908,P0.01),前二者之间也呈显著正相关(r=0.944,P0.01)。结论:TRAF6、NF-κB m RNA表达在IIMs小鼠肌肉中上调,TRAF6可能通过NF-κB的激活在IIMs发生发展过程中发挥重要作用。