建立洁净区微生物数据库与无菌药品GMP生产过程控制的探讨

目的 建立洁净区微生物数据库,为追溯洁净区微生物污染来源提供依据,为无菌药品生产过程控制提供有力指导.方法 对乙型脑炎减毒活疫苗生产车间洁净区环境和操作人员进行微生物负载检测,并对该车间注射用水、纯化水系统样品进行微生物限度检测,鉴别研究相应分离菌,建立洁净区微生物数据库.同时对乙型脑炎减毒活疫苗中间产品进行无菌检查检测,并对阳性结果分离菌进行鉴别分析.然后根据建立的洁净区微生物数据库对阳性结果举例进行溯源探讨分析.结果 洁净区环境和人员主要存在里拉/藤黄微球菌、人葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及科氏葡萄球菌科氏亚种等革兰阳性菌和蜡样芽胞杆菌等,水系统中则主要存在少动鞘氨醇单胞菌和铫子芽胞杆菌等.中间产品无菌阳性结果主要存在里拉/藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌以及奇异变形菌等,经调查分析,分别为操作过程中经环境偶然带入或试验动物操作不慎带入.结论 建立洁净区微生物数据库是追溯产品微生物污染来源的有效方法,能够为无菌药品GMP生产过程制定有效的控制措施提供依据,并使其更有针对性.     

sTACI-Fc-Myc重组质粒的构建、原核表达及活性鉴定

目的:构建s TACI-Fc-Myc重组质粒,并进行原核表达和纯化具有生物活性的融合蛋白。方法:通过PCR法获得s TACI-Fc-Myc重组片段,然后把融合基因片段与原核载体p ET28a连接在一起,并构建p ET28a-s TACI-Fc-Myc重组子,并转入BL21(DE3)中进行表达,用蛋白A凝胶亲和层析柱进行纯化及酶联免疫吸附剂(ELISA)法测定其生物学活性。结果:获得了s TACI-Fc-Myc重组质粒,且该质粒可以在BL21(DE3)中表达,亲和层析柱纯化后纯度可达到95%以上,与BAFF的结合活性具有剂量依赖性,浓度达到5 ng/μL时,两者的吸附达到饱和。结论:成功构建了s TACI-Fc-Myc原核表达载体,并使有生物学活性的融合蛋白在BL21(DE3)上获得了稳定表达,为进一步研究并筛选高活性BAFF拮抗肽奠定了基础。     

全基因组SHIV-KB9克隆的构建及其在人、猴外周血单核细胞中的复制

将分别携带SHIV-KB9 (SIV/HIV-1 KB9) 基因组的3′端和5′端的两个半长克隆,体外连接成SHIV-KB9全基因组克隆.含有全长基因的质粒培养时易发生同源重组和缺失,采用JM109作为宿主菌以及30℃、低转速的培养条件,可保持质粒的稳定性.通过PCR , RT-PCR 和猴免疫缺陷病毒(SIV) gag p27 核心抗原滴度检测表明感染性克隆SHIV-KB9可有效在人、恒河猴及食蟹猴的外周血单核细胞中复制.     

洁净室环境监测用培养基贮存效期的验证及方法学确认

目的验证洁净室环境监测用培养基的贮存效期,同时对环境监测浮游菌、沉降菌及表面微生物检测方法进行确认。方法对连续3批次贮存0、90、120 d洁净室环境监测用胰酪大豆胨琼脂(Tryptose soya agar,TSA)培养皿和TSA(L-80)接触皿进行相应菌液适用性检查(包括促生长能力和无菌检查)验证试验;并对贮存120 d TSA培养皿和TSA(L-80)接触皿分别进行环境浮游菌和沉降菌、表面微生物最长采样时间检测,然后再进行促生长能力测试。结果 TSA培养皿和TSA(L-80)接触皿贮存120 d (2～8℃90 d,25℃30 d)的适用性检查结果均符合《中国药典》2015版(三部)对培养基质量控制的要求。贮存120 d TSA培养皿进行洁净室环境浮游菌(主动采样10 min)、沉降菌(暴露采样4 h),以及TSA(L-80)接触皿进行表面微生物(接触采样10 s)检测后均具有良好的促生长能力。结论通过验证试验,确定了环境监测用TSA培养皿和TSA(L-80)接触皿的贮存效期120 d(2～8℃90 d,25℃30 d),并确认了贮存后TSA培养皿进行洁净室环境浮游菌、沉降菌检测的有效性,以及TSA(L-80)接触皿进行表面微生物检测的有效性。     

HIV-1 Gag蛋白在大肠杆菌表达系统中诱导和纯化条件的优化

为探讨诱导温度对于HIV-1 Gag在大肠杆菌中表达产物状态以及尿素浓度对蛋白纯化效果的影响, 将30oC和37oC诱导表达的包涵体分别溶于不同浓度的尿素, 比较溶解性的差异, 并比较复性的不同。将30oC诱导的目的蛋白分别用2 mol/L和8 mol/L尿素溶解后做层析分离, 比较两者的分离效果。结果发现, 与37oC相比, 30oC诱导表达的蛋白能有效溶于低浓度尿素, 并且更容易复性。与8 mol/L尿素溶解相比, 30oC诱导的包涵体用2 mol/L尿素溶解后通过凝胶过滤和离子交换层析纯化能得到更好的分离效果。这提示低温诱导的Gag包涵体中可能含有更多类似天然态构象的蛋白, 而低浓度尿素有利于保持包涵体中蛋白的天然态构象。从而为包涵体蛋白的诱导表达和分离纯化提供了参考。     

HIV整合酶在大肠杆菌中的表达纯化及其应用

采用pThioHisB系统表达HIV-1整合酶P31蛋白,目的蛋白的表达量达到菌体蛋白的30%左右。通过包涵体洗涤和离子交换层析,蛋白纯度高于95%。用纯化后的P31抗原制备成条带免疫试纸条,检测HIV参考品血清时表现了很好的灵敏度和特异性。本研究为进一步开发HIV-1血清学诊断试剂盒奠定了基础。     

玉米(籽粒)是观察胞间连丝的好材料

取玉米籽粒(颖果)浸泡在盛有清水的烧杯中一天左右。用镊子剥去表皮,露出糊粉层,制作徒手切片,注意刀口与糊粉层平行。把切成的薄片放在盛有清水的培养皿中。用镊子或毛笔挑取厚度均匀的薄片(不要破坏糊粉层细胞),放在载片的水滴上,或加一滴番红液,加盖片后在高倍镜下观察,即可清晰地看到胞间连丝。效果较好。     

HIV整合酶在大肠杆菌中的表达纯化及其应用

采用pThioHisB系统表达HIV-1整合酶P31蛋白,目的蛋白的表达量达到菌体蛋白的30%左右.通过包涵体洗涤和离子交换层析,蛋白纯度高于95%.用纯化后的P31抗原制备成条带免疫试纸条,检测HIV参考品血清时表现了很好的灵敏度和特异性.本研究为进一步开发HIV-1血清学诊断试剂盒奠定了基础.     

氧化樟脑注射液联合厄贝沙坦治疗心力衰竭的疗效及对血清NT-pro-BNP、NE水平的影响

目的:探讨氧化樟脑注射液联合厄贝沙坦治疗心力衰竭的疗效及对血清氨基末端脑钠肽前体(NT-pro-BNP)、去甲肾上腺素(NE)水平的影响。方法:选择2015年3月-2017年3月我院收治的心力衰竭患者80例进行研究,根据随机数表法将其分为观察组(n=41)和对照组(n=39)。对照组给予厄贝沙坦治疗,观察组在对照组的基础上加用氧化樟脑注射液治疗。比较两组患者的临床疗效、治疗前后血清NT-pro-BNP、NE水平、左室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期容积(LVESV)、左心室收缩末内径(LVESD)、左心室射血分数(LVEE)水平的变化及不良反应的发生情况。结果:治疗后,观察组总有效率为95.12%,显著高于对照组(71.79%,P0.05)。两组患者治疗后血清NT-pro-BNP、NE、LVEDD、LVESD、LVESV水平均较治疗前显著降低,LVEE显著上升,且观察组血清NT-pro-BNP、NE、LVEDD、LVESD、LVESV水平明显低于对照组(P0.05),而LVEE显著高于对照组(P0.05)。观察组不良反应的发生率为4.88%,明显低于对照组(23.08%,P0.05)。结论:氧化樟脑注射液联合厄贝沙坦治疗心力衰竭的临床效果显著优于单用厄贝沙坦治疗,其可有效改善患者NT-pro-BNP、NE水平,且安全性较高。     

食蚊鱼（Gambusia spp.）入侵生态学研究进展

食蚊鱼(Gambusia spp.)是原产于北美洲的著名入侵物种,它对蚊类幼虫具有很强的捕食压力,被作为疟疾防治生物工具而在全世界温带和热带地区扩散.近20多年来的研究认为,食蚊鱼通过食物竞争和捕食等机制威胁引入地的无脊椎动物、鱼类、两栖类的生存,显著影响引入地的生物多样性.它们具有广泛的生境适应性、生长迅速、卵胎生、高生殖率、对生殖生态条件无特殊要求等特点.另外,它们的个体野外寿命不超过2a,种群更新速度快,种群内形成春季和夏季两个繁殖群体,并具有不同的繁殖生物学特点,因而形成复杂的世代结构.遗传上,雌鱼具有混交及能长期贮存精子的特点,能快速建立种群并克服奠基效应.这些种群通过快速适应性进化而形成一定规模的地理群体.当前,由于食蚊鱼在预防疟疾的工作中仍具有不可替代的作用,它会借助于人力的作用而继续扩散.为减轻它对非目标地区和非目标生物的影响,应进一步深入开展其入侵生态学研究.