鹅细小病毒结构蛋白B细胞线性抗原表位的鉴定

为了对鹅细小病毒结构蛋白B细胞线性抗原表位进行进一步定位,设计了16个覆盖结构蛋白各抗原表位区的长约30个氨基酸残基的重叠短肽,并进行了融合表达。用攻毒10周龄鹅血清对这16个融合蛋白进行蛋白质印迹分析,检测结果表明,VP蛋白线性抗原表位位于35-81、111-161、423-453、462-491、531-577、616-669和678-732氨基酸区域。     

米根霉菌ldhL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以米根霉菌基因组DNA为模板,根据GenBank上已公布的米根霉L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)序列设计特异性引物,PCR扩增得到963 bp的DNA片段,经序列分析后将其亚克隆到原核表达载体pET30a上,构建成重组质粒pET30a-ldhL.将pET30a-ldhL转化到BL21感受态细菌中,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,可见约43 kD的与预期大小一致的目的蛋白条带,结果表明ldhL基因在大肠杆菌中进行了表达,经酶活分析产物的酶活力为98 U/mL,证明了表达产物具有预期的酶活性,这为进一步研究利用乳清为发酵原料高产L-乳酸的米根霉基因工程菌株奠定了基础.     

抗鹅免疫球蛋白轻链单克隆抗体的鉴定及其应用

免疫球蛋白是机体固有免疫系统的组成部分,是机体防御的第一道防线。本研究对抗鹅免疫球蛋白轻链单克隆抗体进行了特征分析并将其应用到不同免疫试验中用以检测鹅免疫球蛋白。用此单克隆抗体制备的免疫亲和层析柱用以分离血清中的鹅免疫球蛋白;偶联辣根过氧化物酶 (Horseradish peroxidase,HRP) 后的单克隆抗体用作第二抗体来检测鹅特异性抗体。此外,该单克隆抗体可以识别和定位外周血淋巴细胞中的SIg+淋巴细胞。研究表明,该单克隆抗体可在多种条件下检测或分离鹅免疫球蛋白并作为研究鹅体液免疫的有力工具。     

重组野猪α-干扰素基因的高效表达和下游工艺的研发

利用PCR方法,从东北野猪和长白猪的肌肉基因组DNA中分别扩增出一条501bp的基因片断 ,与GenBank上登载的猪α-干扰素基因序列相比,核苷酸同源性达到98.4%以上。以其中野猪α-干扰素基因片断为参考模板,经过密码子优化、5?和3?区域的mRNA二级结构优化,全基因合成得到编码野猪α-干扰素基因成熟肽的基因。克隆该基因到原核表达载体pWL之中.随后转化至宿主菌DH-5α。经过SDS-PAGE电泳检测,发酵后的重组野猪IFN-α-干扰素基因的蛋白表达量大于25%。复性纯化后的重组蛋白,经过VSV-WISH系统检测,其生物活性为4.45×106IU/mg。     

鸭肠炎病毒gB基因的分子特征

鸭肠炎病毒是鸭病毒性肠炎的病原,被划分为疱疹病毒科成员.gB是疱疹病毒感染和复制所必需的糖蛋白,能刺激机体产生中和抗体和细胞免疫应答,在疱疹病毒家族中高度保守.通过PCR技术获得了DEV C-KCE株gB基因的核苷酸序列,首次对DEV gB基因及编码氨基酸进行了较为详尽的生物信息学分析.结果表明,DEV gB基因与α-疱疹病毒的马立克氏病毒属亲缘关系最近;DEV gB蛋白具有与其他疱疹病毒gB相同或相似的结构、N糖基化位点、半胱氨酸残基、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)结合位点、弗林蛋白酶水解位点和胞浆区PACS-1识别位点.     

检测小鹅瘟感染抗体的Dot-ELISA方法研究*

以GPV VP1-VP3非重叠序列重组原核表达多肽为检测抗原,建立了鉴别GPV感染抗体的Dot-ELISA方法,试验确定检测抗原包被浓度分别为700ng; 兔抗鹅IgG-HRP-标记抗体的最适稀释度为1∶200;被检血清最佳稀释度为1∶400。检测GPV血清抗体的阳性率为100%;检测鸡抗GPV VP3禽痘重组病毒血清的阳性率为0 %。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在毕赤酵母中的表达

采用基因重组的方法构建了含有猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris分泌型表达载体pPIC9K-ts,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,大量筛选后获得高效表达外源蛋白的毕赤酵母工程菌株GS115/pPIC9K-ts。表达蛋白经Dot-ELISA检测具有良好的抗原性。本研究为TGE的血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。     

诺如病毒CHN02/LZ35666株RdRp和VP1基因序列分析

诺如病毒（Noroviruses,NVs）为杯状病毒科的一个属,是引起人类病毒性胃肠炎暴发的重要病原。在美国、欧洲和日本,病毒性胃肠炎暴发中由NV引起的占93％。NV的基因组为单股正链RNA,全长约7．7kb,由3个开放阅读框（open reading frames,ORFs）组成,ORF1编码非结构蛋白,其中包括RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase,RdRp）,0RF2和0RF3分别编码主要（VP1）和次要（VP2）衣壳蛋白。VP1蛋白折叠成两个区域,壳区（Shell,S）和突出区（Protruding,P）,S区形成内壳,P区形成拱样结构突出于内壳外。P区进一步分为P1和P2亚区,后者位于衣壳的最外面,P2区相对于S区和P1区序列高度变异,被认为是免疫识别和受体结合的关键部位。     

牛病毒性腹泻病毒NS3基因的序列分析、表达与抗原性鉴定

本研究应用套式RT-PCR方法扩增出牛病毒性腹泻病毒VEDEVAC株编码NS3蛋白的基因,克隆至表达载体pET-30a(+),并进行测序。对瘟病毒属病毒NS3基因进行氨基酸差异性分析,显示平均P-distance为0.07,系统进化树分析表明VEDEVAC株隶属于BVDV1型。将构建成功的重组质粒转化大肠埃希氏菌Rosetta(DE3),在IPTG诱导下表达NS3重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化和尿素梯度透析后进行反应原性鉴定。Western blotting结果显示表达的重组蛋白可以与牛病毒性腹泻病毒阳性血清反应,并与猪瘟阳性血清有交叉反应,ELISA结果显示该重组蛋白具有良好的反应原性。所获得的蛋白为建立针对NS3抗体的ELISA检测方法奠定了基础。     

T细胞IFN-g表达水平检测方法的建立及其在马传染性 贫血疫苗免疫机理研究中的应用

[目的]马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗致弱机制和免疫保护机理的研究可以为慢病毒疫苗的研究提供重要的模型.为探讨IFN-γ表达水平与疫苗保护性免疫的关系,本研究旨在建立一种准确、有效地检测EIAV感染马不同T细胞亚型表达IFN-γ水平的方法.[方法]我们将分离的马传贫弱毒疫苗免疫马(FDDV)、强毒感染马(LV)和健康马的外周血单核细胞(PBMC),体外分别经病毒(FDDV)和PMA/Inomycin激活、 BFA 阻断蛋白分泌、荧光标记马的特异性表面抗体和IFN-γ抗体等过程后,进行流式检测.[结果]疫苗免疫马产生的特异性IFN-γ水平为CD4 1.7(0.9%/CD8 6.1(1.2%,而强毒组则为CD4 0.6(0.1%/CD8 2.4(0.9%.[结论]本研究建立的多荧光参数流式细胞术同时检测细胞内IFN-γ染色和淋巴细胞亚型的方法,具有良好的特异性,稳定性和重复性.为研究EIAV弱毒疫苗免疫保护机制奠定了基础.