口服草原兔尾鼠卵透明带3纳米乳剂DNA疫苗免疫效果研究

用免疫不育疫苗控制有害动物的数量成为动物种群数量控制的一个有效措施,对于大多数动物来说．口服饵料发送系统是最好的选择。但是口服疫苗容易产生耐受,且生物利用度低,利用多聚物包裹口服疫苗是一种打破口服耐受．提高其生物利用度的新途径。本文以纳米乳剂作为草原兔尾鼠卵透明带3（Lugurus zone pellucida 3,LZP3）DNA疫苗的发送载体,探讨通过口服途径增强小鼠的免疫效果和抗生育率。用纳米乳剂包裹lzp3 DNA疫苗后,采用强阴离子交换色谱法测定纳米乳剂的包封率．将制备好的质粒纳米乳剂lzp3 DNA疫苗通过口服饵料免疫小鼠,检测到免疫后小鼠的体内产生了特异性的抗LZP3的IgG和IgA。对免疫后小鼠进行抗生育实验,分析生育后免疫小鼠的卵巢病理切片。研究结果表明,用质粒纳米乳剂如p3DNA疫苗通过口服途径免疫．在小鼠的血清和粘液中检测到了特异性的抗LZP3的IgG和IgA,同时也产生了相应的抗生育作用．表明纳米乳剂作为口服不育疫苗的发送载体是可行的,为草原兔尾鼠鼠害的防治提供了理论基础．     

草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究

为探讨不同种类小鼠卵透明带3（zp,）的免疫不育效果,并筛选高效且具有物种特异性的DNA抗生育疫苗,本研究选择草原兔尾鼠卵透明带3（Lzp3）和昆明白小鼠卵透明带3（Mzp3）构建不同的DNA抗生育疫苗表达载体,pcDNA3-mzp3（pcD-M）、pcDNA3-1zp3（pcD-L）、pcDNA3-aat-comp-mzp3（pcD-ACM）和pcDNA3-aat-comp-lzp3（pcD-ACL）分别免疫NIH小白鼠。研究中用水动力转染技术取代传统的Hela细胞真核转染检测小鼠体内真核表达情况．结果表明四种质粒均能在小鼠肝脏中进行表达;ELISA图示表明重组质粒均能使小鼠激发较高水平的特异性抗体;抗生育结果表明四种DNA疫苗均具有免疫不育的效果（P〈0．05）,其中pcDNA3-aat-comp-mzp3（pcD-ACM）的免疫效果最好（P〈0．01）;卵巢病理切片H．E染色结果显示pcD-M和pcD-L组卵巢结构与对照小鼠区别不大,而pcD-ACL和pcD-ACM组卵巢结构发生病理性变化。结果初步说明草原兔尾鼠和昆明白小鼠卵透明带3对NIH小白鼠均有抗生育效果,但不具有物种特异性。     

壳聚糖介导增强DNA疫苗皮肤免疫效果的研究

目的:探讨壳聚糖(chitosan)包裹DNA疫苗皮肤免疫效果。方法:以chitosan包裹不同的草原兔尾鼠卵透明带3(LZP3)基因DNA疫苗pcDNA3-Lzp3(pLzp3)和pLC,通过皮肤擦拭免疫小鼠,以ELISA方法检测抗体水平,对卵巢做病理切片检测。结果:ELISA结果显示用chitosan包裹的pLC组在皮肤免疫中显示出优势,卵巢病理切片结果正常。结论:Chitosan包裹质粒皮肤免疫小鼠较纯质粒免疫效果更为显著。     

聚乙二醇修饰的壳聚糖包裹DNA的转染效果研究

目的:为探讨聚乙二醇(PEG,MW4000)修饰的壳聚糖用于包裹质粒DNA(Chi-DNA)是否能有效提高口服发送的外源基因在消化道中的表达量.方法:用PEG修饰的壳聚糖包裹不同剂量(10μg,50μg,100μg)的质粒(pCMVβ),形成壳聚糖纳米复合物,通过口服发送后经X-gal染色法检测pCMVβ在小鼠消化道内的表达效果.结果:胃酸消化实验及DNase Ⅰ消化实验均表明经PEG修饰的壳聚糖纳米粒能有效地保护DNA,使其免受胃酸及Dnase Ⅰ的降解.同时在小鼠消化道内的表达量较修饰前明显增加,随着所发送DNA剂量的增加,表达量也相应增加,且包裹10μg质粒的DNA纳米复合物的表达量相当于100μg未修饰复合物的表达水平.结论:经PEG修饰的Chi-DNA纳米复合物有较高的基因转染效果,有望作为基因治疔中高效非病毒口服发送系统的材料.     

分子佐剂C3d增强草原兔尾鼠卵透明带3 DNA疫苗的免疫应答

为增强免疫不育的效果,探讨分子佐剂C3d对草原兔尾鼠透明带3(LaguruslagurusZonaPellucida3,LZP3)基因免疫的调节作用。构建了含3个拷贝C3d的lzp3基因真核细胞表达质粒pcDNA3-LZP3-C3d3(pcD-LC),以不含C3d的质粒pcDNA3-LZP3(pcD-L)为对照,体外转染HeLa细胞,RT-PCR和Westernblot分别检测到lzp3mRNA和蛋白的表达。对NIH雌性小鼠肌肉进行基因免疫注射,ELISA结果表明pcD-LC免疫诱导的特异性抗LZP3-IgG水平明显高于pcD-L对照组(P<0.05),且有长期免疫应答效应;MTT结果显示pcD-LC能够诱导淋巴细胞增殖活性的提高。抗生育实验表明pcD-LC免疫组显著降低窝产仔数(P<0.05),且卵巢切片正常。研究结果证实C3d能够增强lzp3DNA疫苗的特异性免疫应答并达到抗生育效果,为DNA疫苗控制草原兔尾鼠的深入研究提供了基础。     

基因修饰乳酸乳球菌作为药物发送载体系统治疗黑色素瘤初探

[目的]探讨携带自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)的重组乳球菌静脉注射后靶向实体肿瘤组织定殖及联合更昔洛韦(GCV)治疗小鼠黑色素瘤的可能性。[方法]荷瘤小鼠静脉注射乳球菌3d或7d后,将小鼠脾肺肝肾器官和肿瘤组织细胞匀浆后涂布于筛选培养基上,以乳酸菌数量的评价静脉发送乳球菌靶向定殖肿瘤细胞的可能性。以携带HSVtk的重组乳酸乳球菌经静脉途径处理荷瘤小鼠后,通过观测小鼠肿瘤体积变化及小鼠存活率评价相关抗肿瘤效果。[结果]静脉注射乳酸乳球菌3d后在小鼠脾肺肝肾和肿瘤组织内均有乳球菌检出,而7d后仅在肿瘤组织中发现有乳酸乳球菌的分布。与对照相比,静脉注射LL-HSV-tk联合GCV处理能显著抑制小鼠体内肿瘤的生长。[结论]静脉发送携带治疗性分子的乳酸乳球菌能靶向实体肿瘤组织定殖并抑制肿瘤的生长。     

DNA疫苗免疫机制及构建优化载体的研究

自20世纪90年代DNA疫苗在免疫学上被第一次提出来以后,10多年来DNA疫苗以其独特的优点而倍受青睐,但近来越来越多关于其免疫效力低下和对灵长类及人等大型动物收效甚微的论证制约着其广泛的应用。即是从DNA疫苗免疫机制方面对构建优化疫苗载体的最新研究进展综述。     

新疆株HPV-16 L1在真核细胞中表达水平的初探

以密码子优化的人乳头瘤病毒16型(HPV-16)主要衣壳蛋白基因L1作为对照研究新疆株HPV-16 L1在真核细胞中的表达水平.将新疆株HPV-16 L1与密码子优化的HPV-16 L1分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1重组质粒通过水动力转染技术注入小鼠体内或采用脂质体法转染293T细胞,RT-PCR检测HPV-16 L1在小鼠肝脏及293T细胞中的转录:western印迹检测HPV-16 L1在293T细胞中表达的蛋白质.结果显示新疆株及密码子优化的HPV-16L1,在小鼠肝脏及293T细胞中均发生转录,但新疆株L1的表达水平显著低于密码子优化L1的表达水平.     

不同修饰对壳聚糖转基因效果的影响

目的:探讨不同修饰的壳聚糖包裹的质粒(Chi-DNA)纳米复合物在口服发送中外源 基因在消化道中的表达差异.方法:分别使用明胶、海藻酸钠、PEG及乙酰化修饰包裹含Lac Z的质粒pCMVa的壳聚糖纳米颗粒,通过口服发送后经X-gal染色检测目的基因在小鼠体内的 表达.结果:修饰后的Chi-DNA纳米复合物都能抵抗胃酸的降解0.5h以上 ,其中PEG及乙酰化 修饰的Chi-DNA纳米复合物在胃酸处理1h时仍有部分残留.X-gal染色显示,修饰后的Chi-DN A纳米复合物都有a半乳糖苷酶的表达,其中PEG、海藻酸钠修饰的Chi-DNA纳米复合物在鼠 胃和小肠中表达量最高.结论:PEG、海藻酸钠修饰的Chi-DNA纳米复合物有望成为高效的基因治疗用非病毒口服发送系统.     

竞争PCR定量检测免疫小鼠细胞因子表达水平

目的：利用竞争PCR技术定量检测各种细胞因子的表达水平。方法：在机体免疫应答过程中,细胞因子作为免疫调节分子在免疫网络系统中发挥重要的调节功能,T细胞能够通过产生并分泌各种细胞因子来调节机体的免疫反应。本研究采用竞争PCR技术,通过提取的小鼠脾脏组织总RNA,经反转录得到cDNA,利用一种修饰的竞争模板pQRS进行竞争PCR扩增,然后利用琼脂糖凝胶电泳分析并与竞争模板产物比较而定量。结论：结果表明竞争PCR能够初步定量免疫前后小鼠脾脏组织表达的IL-2、IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的表达量。为深入研究免疫前后小鼠体内各种细胞因子的动态水平和分析细胞免疫水平奠定了基础。