荒漠甲虫小胸鳖甲抗冻蛋白的酵母表达及应用

昆虫抗冻蛋白(Antifreeze protein,AFP)的抗冻活性很高,可应用于生物组织和细胞的低温保存。为了在酵母中表达荒漠甲虫小胸鳖甲Microdera punctipennis抗冻蛋白Mp AFP698,并确定其在低温下的保护作用,本文通过构建真核表达载体p PIC9K-Mpafp698,转化巴斯德毕赤酵母GS115,诱导表达小胸鳖甲抗冻蛋白Mp AFP698。利用免疫印迹(Western blotting)分析Mp AFP698蛋白的特异性表达,结果显示Mpafp698基因可整合到酵母基因组中并分泌表达,且酵母自身蛋白很少分泌表达。检测抗冻蛋白的低温保护作用,结果发现,小胸鳖甲抗冻蛋白可显著改善冷冻小鼠肝脏等器官的细胞形态,降低血细胞在4℃的溶血率,提高SF9细胞冻融后的存活率。本研究表明,小胸鳖甲AFP可以在毕赤酵母中分泌表达,便于纯化,有良好的低温保护效果。     

聚乙二醇修饰的壳聚糖包裹DNA的转染效果研究

目的:为探讨聚乙二醇(PEG,MW4000)修饰的壳聚糖用于包裹质粒DNA(Chi-DNA)是否能有效提高口服发送的外源基因在消化道中的表达量.方法:用PEG修饰的壳聚糖包裹不同剂量(10μg,50μg,100μg)的质粒(pCMVβ),形成壳聚糖纳米复合物,通过口服发送后经X-gal染色法检测pCMVβ在小鼠消化道内的表达效果.结果:胃酸消化实验及DNase Ⅰ消化实验均表明经PEG修饰的壳聚糖纳米粒能有效地保护DNA,使其免受胃酸及Dnase Ⅰ的降解.同时在小鼠消化道内的表达量较修饰前明显增加,随着所发送DNA剂量的增加,表达量也相应增加,且包裹10μg质粒的DNA纳米复合物的表达量相当于100μg未修饰复合物的表达水平.结论:经PEG修饰的Chi-DNA纳米复合物有较高的基因转染效果,有望作为基因治疔中高效非病毒口服发送系统的材料.     

不同修饰对壳聚糖转基因效果的影响

目的:探讨不同修饰的壳聚糖包裹的质粒(Chi-DNA)纳米复合物在口服发送中外源 基因在消化道中的表达差异.方法:分别使用明胶、海藻酸钠、PEG及乙酰化修饰包裹含Lac Z的质粒pCMVa的壳聚糖纳米颗粒,通过口服发送后经X-gal染色检测目的基因在小鼠体内的 表达.结果:修饰后的Chi-DNA纳米复合物都能抵抗胃酸的降解0.5h以上 ,其中PEG及乙酰化 修饰的Chi-DNA纳米复合物在胃酸处理1h时仍有部分残留.X-gal染色显示,修饰后的Chi-DN A纳米复合物都有a半乳糖苷酶的表达,其中PEG、海藻酸钠修饰的Chi-DNA纳米复合物在鼠 胃和小肠中表达量最高.结论:PEG、海藻酸钠修饰的Chi-DNA纳米复合物有望成为高效的基因治疗用非病毒口服发送系统.