结合三代测序与二代测序技术揭示蜜蜂球囊菌孢子转录组的复杂性

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是一种专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在利用PacBio单分子实时(singlemoleculereal-time,SMRT)测序技术对蜜蜂球囊菌孢子(AaS)中基因的可变剪切(alternative splicing,AS)和可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)以及长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)进行鉴定和分析,进而揭示蜜蜂球囊菌孢子中转录组的复杂性。【方法】采用Suppa软件对蜜蜂球囊菌孢子中基因的AS事件进行鉴定。通过RT-PCR对不同类型的AS事件进行验证。采用TAPIS pipeline对蜜蜂球囊菌孢子基因的APA位点进行鉴定。利用MEME软件分析孢子全长转录本的poly(A)剪接位点上游50bp的序列特征并鉴定motif。联用CPC和CNCI软件和比对Swiss-prot数据库的方法预测lncRNA,取三者的交集作为高可信度的lncRNA集合。进一步比较lncRNA和mRNA的转录本长度,外显子数量与长度,内含子长度,GC含...     

东方蜜蜂微孢子虫LCFAL2基因的分子特性及系统进化分析

本研究旨在解析东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的长链脂肪酸辅酶A连接酶(long chain fatty acid COA ligase)基因LCFAL2的分子特性,鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的LCFAL2蛋白的保守基序和结构域并进行系统进化分析,以期丰富东方蜜蜂微孢子虫LCFAL2的信息,为深入开展相关功能研究提供基础。通过Expasy网站上的相关软件预测和分析LCFAL2的理化性质、跨膜螺旋域、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种LCFAL2蛋白的保守基序。采用TBtools软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种LCFAL 2的结构域。通过Mega 11.0软件构建东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的LCFAL 2的系统进化树。结果表明,东方蜜蜂微孢子虫LCFAL 2含有1 836个核苷酸,可编码611个氨基酸,分子式为C3145H4985N813O904S23,分子量约为69.39 kDa,脂溶系数为96.82,等电点为8.79,平均亲水系数为-0.161;不含跨膜螺旋域和典型信号肽;包含27个丝氨酸酸化位点,14个酪氨酸酸化位点及23个苏氨酸磷酸化位点;包含240个α-螺旋,124个延长链,48个β-转角及199个无规则卷曲;可同时定位于细胞核、细胞质和线粒体;另外,LCFAL2及其模板5mst.1.A之间的同源性为21.44%。东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫Nosema apis等9个物种的LCFAL 2中均含有6个相同的保守基序。东方蜜蜂微孢子虫、管孢属微孢子虫Tubulinosema ratisbonensis、蜜蜂微孢子虫、巨蟹肠孢菌Enterospora canceri、烟粉虱Spraguea lophii、毕氏肠细胞虫Enterocytozoon bieneusi、东方赤孢子虫Hamiltosporidium tvaerminnensis和褶皱臂尾轮虫Brachionus plicatilis的LCFAL 2均包含AFD_class_I superfamily结构域。东方蜜蜂微孢子虫LCFAL2(XP_024331795.1)与蜜蜂微孢子虫LCFAL2(EQB61677.1)聚为一支,进化距离最近。研究结果明确了东方蜜蜂微孢子虫LCFAL2的分子特性,并揭示LCFAL2可能是亲水性蛋白、胞内蛋白和非跨膜蛋白,东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫的LCFAL2之间的亲缘关系最近,LCFAL2在东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫中具有较高的保守性。     

东方蜜蜂微孢子虫类甲基转移酶样蛋白5基因NcMettl5的克隆、分子特性与表达模式

N⁶-甲基腺苷(N⁶-methyladenosine,m⁶A)是真核生物中分布广泛、含量丰富且作用关键的一类RNA修饰。东方蜜蜂微孢子虫Nosemaceranae专性侵染成年蜜蜂导致微孢子病,给养蜂业造成很大损失。本研究对东方蜜蜂微孢子虫的甲基转移酶样蛋白5(Methyltransferase-likeprotein5,Mettl5)基因NcMettl5进行克隆,通过生物信息学预测NcMettl5蛋白的理化性质和分子特性,并通过RT-qPCR检测NcMettl5在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂过程的相对表达量,以期丰富NcMettl5的信息,并为探究东方蜜蜂微孢子侵染中NcMettl5的功能及调控机制提供基础。结果表明,扩增出约600bp的目的片段,与GenBank数据库收录的预测出的NcMettl5序列一致;NcMettl5的分子量约为22.64kDa,分子式为C₁₀₃₉H₁₆₄₅N₂₆₉O_2...     

ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用

【目的】本研究旨在揭示ame-miR-14在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂幼虫肠道发育过程的调控作用。【方法】通过Stem-loop RT-PCR和Sanger测序分别验证ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中的表达和序列真实性。饲喂ame-miR-14的模拟物(mimic-ame-miR-14)和抑制物(inhibitor-ame-miR-14)及其相应的阴性对照mimic-NC和inhibitor-NC对ame-miR-14分别进行过表达和敲降,利用RT-qPCR检测意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中ame-miR-14的表达量。利用生物信息学软件预测ame-miR-14的靶基因并进行相关分析。利用RT-qPCR检测ame-miR-14的过表达和敲降后其靶基因FoxO和Hedgehog在4-6日龄幼虫肠道中的相对表达量。【结果】ame-miR-14在意大利蜜蜂工蜂6日龄幼虫肠道中真实存在和表达。相较于饲喂mimic-NC,饲喂mimic-ame-miR-14后ame-miR-14表达量在意大利蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中均为显著上调;相...     

东方蜜蜂微孢子虫孢子中微小RNA的鉴定与分析

【目的】丰富东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的微小RNA(microRNA, miRNA)信息,并为深入探究miRNA在病原孢子和病原侵染中的功能提供理论和实验依据。【方法】基于已获得的small RNA-seq数据,利用生物信息学软件对东方蜜蜂微孢子虫的纯净孢子中的miRNA进行鉴定和分析。采用茎环反转录PCR(stem-loop RT-PCR)检测已鉴定的miRNA的表达;通过分子克隆与Sanger测序验证miRNA的序列。使用TargetFinder软件预测这些miRNA的靶基因,并对靶基因进行数据库注释。根据miRNA与靶基因的靶向结合关系构建调控网络,再利用Cytoscape软件进行可视化。【结果】在东方蜜蜂微孢子虫孢子中共鉴定到10个miRNA;这些miRNA的长度分布介于21~25 nt,首位碱基表现出U偏向性,每一位碱基的偏向性差异明显。Stem-loop RT-PCR检测结果表明这10个miRNA均真实表达;Sanger测序结果证实了随机选取的其中2个miRNA的序列真实性。共预测出249个靶基因,其中分别有249, 118, 136和3个靶基因可注释到Nr,Swiss-Prot, KOG和eggNOG数据库。此外,分别有134和71个靶基因可分别注释到GO数据库的30个功能条目和KEGG数据库的54条通路。【结论】本研究揭示了东方蜜蜂微孢子虫孢子中miRNA的存在和表达;这些miRNA通过调控潜在靶基因的表达参与孢子的生命活动。     

意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本鉴定及验证

【目的】利用前期获得的高质量纳米孔长读段测序数据对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本进行鉴定和分析,为深入开展功能研究提供参考信息和基础。【方法】基于前期获得的高质量意大利蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将意大利蜜蜂全长转录本比对Nr数据库筛选出丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因和全长转录本;利用gffcompare软件将筛选出的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶全长转录本与西方蜜蜂A.mellifera参考基因组(Amel＿HAv3.1)上注释的转录本进行比较,以鉴定未注释的新基因和新转录本;使用Astalavista软件鉴定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件类型,采用IGV浏览器对剪接体的结构进行可视化,通过RT-PCR验证随机选取的6次AS事件的真实性。【结果】共鉴定到意大利蜜蜂丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶71个基因和335条全长转录本,发掘出未注释的1个新基因和97条新转录本;共对14个已注释基因进行了结构优化,分别延伸了6个基因的5′端和8个基因的3′端。共鉴定到意大利...     

过表达和敲减ame-miR-13b对意大利蜜蜂幼虫肠道内基因表达的影响

【目的】微小RNA(microRNAs, miRNAs)在昆虫的繁殖、发育和免疫等重要生命活动的调控过程中扮演关键角色。本研究旨在探究在意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫个体水平过表达与敲减ame-miR-13b对其靶基因表达的影响,为深入探究ame-miR-13b调控意大利蜜蜂幼虫肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。【方法】根据ame-miR-13b的核苷酸序列设计合成相应的模拟物mimic-ame-miR-13b和抑制物inhibitor-ame-miR-13b及其对照mimic-NC和inhibitor-NC,混入饲料后饲喂意大利蜜蜂3日龄幼虫,每12 h更换一次饲料,连续饲喂6次,以分别过表达和敲减ame-miR-13b;通过RT-qPCR检测过表达和敲减ame-miR-13b后意大利蜜蜂幼虫肠道中ame-miR-13b及其靶基因Ecr, Egfr和P450 18a1的表达量。【结果】与mimic-NC饲喂组相比, mimic-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在意大利蜜蜂4和6日龄幼虫肠道中均显著上调表达;与饲喂inhibitor-NC组相比,inhibitor-ame-miR-13b饲喂组中ame-miR-13b在4日龄幼虫肠道中下调表达,在5和6日龄幼虫肠道中显著下调表达。与mimic-NC饲喂组相比,过表达ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr的表达量显著降低,而Ecr和P450 18a1的表达量均显著升高。与inhibitor-NC饲喂组相比,敲减ame-miR-13b组中意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr上调表达但不显著,Ecr显著上调表达,而P450 18a1显著下调表达。【结论】通过饲喂法在意大利蜜蜂幼虫个体中成功实现了miRNA的过表达和敲减;ame-miR-13b与Egfr之间存在潜在的负调控关系。