湖南工程学院生物工程专业实践 教学模式创新与实践

分析生物工程专业人才需求的现状与发展前景,构建了以社会需求为导向,以实践课程体系为载体,以能力培养为主线,以学生科技创新活动和教师科研为驱动,项目研究与能力培养相结合的创新实践教学模式.实践表明,创新实践教学模式极大提高了学生的学习兴趣和教师的工作热情.     

脑挫裂伤致miR-9 升高促进神经干细胞分化

目的:探讨颅脑损伤后miR-9表达的变化和对神经干细胞分化和增值的影响,为颅脑损伤后神经功能修复治疗提出新的思路。方法:通过RT-PCR技术检测miR-9在挫裂伤脑组织中的表达情况;培养胚胎来源神经干细胞,并通过免疫荧光鉴定神经干细胞及其分化;转染miR-9后,通过MTT测定神经干细胞的增殖情况,和流式细胞仪检测分化神经元所占比例。结果:miR-9在挫裂伤脑组织中表达显著上升。对神经干细胞过表达miR-9可显著促进细胞增殖,并诱导分化成神经元。结论:脑挫裂伤时miR-9显著升高,并具有着促进神经干细胞增值和诱导分化的作用,可为伤后神经功能修复提供新的治疗方法。     

Aβ42转基因AD果蝇的构建及在药物筛选中的运用

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以β-淀粉样蛋白的形成和沉积为主要特征的神经退行性疾病,Aβ42被认为在AD的发病过程中起着重要的作用。果蝇是一种遗传操作简便的模式动物,利用果蝇中经典的Gal4／UAS系统,作者构建了在中枢神经系统中全神经元或运动神经元表达单拷贝或双拷贝AB42的转基因AD果蝇,并检验转基因果蝇在AD治疗药物筛选中的作用。结果显示,转基因AD果蝇寿命明显缩短且运动能力降低,而使用AD临床治疗药物安理申后,可延长AD果蝇寿命,改善AID果蝇的运动障碍。进一步的研究显示,δ阿片受体拮抗剂naltrindole给药后,也能缓解这些症状。该研究为AD治疗药物的初筛提供了一个经济便捷的工具。     

果蝇来源的GPCR Methuselah G蛋白偶联信号转导通路研究

Methuselah(MTH)是果蝇来源的GPCR中的一员,它的突变可延长果蝇平均寿命并提高果蝇对外界胁迫因素的耐受性。但目前对MTH在细胞水平的信号转导研究鲜有报道。该研究用稳定表达MTH的HEK293细胞株,对与该受体偶联的G蛋白选择性做了研究。首先,用免疫荧光染色、Western blot及钙流实验验证了MTH在HEK293/Myc-MTH细胞表面能稳定表达,且具有正常生物学活性;MTH受体被其配体N-stunted活化后所引起细胞内钙的上升不能被PTX预处理抑制,提示活化的MTH可能通过与Gq/11而非Gi/o蛋白相偶联;进一步研究发现,MTH激活后不显著改变细胞中的cAMP水平,表明MTH不与Gs和Gi/o相偶联;MTH被激活后可引起ERK磷酸化。这些结果提示:MTH可能是Gq/11蛋白的偶联受体,为进一步研究MTH的下游信号转导和生物学功能奠定了基础。     

两种新型HBsAg基因的毕赤酵母表达载体构建及其表达

目的：从乙肝患者血清中发现2个有突变的乙型肝炎病毒株,从中扩增出HBsAg(乙肝表面抗原)基因,构建酵母表达载体,并在巴斯德毕赤酵母中表达,以鉴定这2个基因表达产物的活性。方法：利用PCR技术从乙肝患者血清中扩增出乙肝表面抗原基因．并将其连接到pPIC3．5K中,转化毕赤酵母,通过甲醇诱导,利用SDS-PAGE和ELISA检测表达的蛋白。结果：通过序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和ELISA证明这2个基因在毕赤酵母中能有效表达。且表达产物均具有生物活性。结论：从实验结果发现乙肝表面抗原决定簇以外的少数氨基酸变化不影响其活性。因此可以利用这2个基因对乙肝表面抗原进行表达。     

GAPDH基因克隆及其作为毕赤酵母内标物的可靠性研究

为了测定GAPDH在巴斯德毕赤酵母中作为内参蛋白的有效性,利用PCR鉴定巴斯德毕赤酵母中GAPDH基因,分别在含葡萄糖、甲醇、甘油培养基及不同温度下培养巴斯德毕赤酵母,采用SDS-PAGE、Western blotting和催化活性检测。测序结果与已报道的巴斯德毕赤酵母GAPDH基因完全一致。SDS-PAGE结果显示,表达蛋白分子量为35.4 kD,与预期分子量相符。Western blotting和催化活性测定显示,在葡萄糖诱导下GAPDH表达最高,甲醇次之,甘油最低。37℃下GAPDH表达略高于28℃。在同一诱导物或温度下,GAPDH表达不会随浓度或培养时间发生明显变化。结果表明,在同一种诱导方式下,GAPDH可以作为异源蛋白表达的内参对照。     

脑挫裂伤致miR-9升高促进神经干细胞分化

目的：探讨颅脑损伤后miR-9表达的变化和对神经干细胞分化和增值的影响,为颅脑损伤后神经功能修复治疗提出新的思路。方法：通过RT-PCR技术检测miR-9在挫裂伤脑组织中的表达情况;培养胚胎来源神经干细胞,并通过免疫荧光鉴定神经干细胞及其分化;转染miR-9后,通过MTT测定神经干细胞的增殖情况,和流式细胞仪检测分化神经元所占比例。结果：miR-9在挫裂伤脑组织中表达显著上升。对神经干细胞过表达miR-9可显著促进细胞增殖,并诱导分化成神经元。结论：脑挫裂伤时miR-9显著升高,并具有着促进神经干细胞增值和诱导分化的作用,可为伤后神经功能修复提供新的治疗方法。     

双水相体系萃取人参根中人参皂苷的研究

建立稳定的聚乙二醇(PEG)与(NH4)2SO4双水相体系以分离人参根中人参皂苷。通过上下相体积比(R)、分配系数(K)和回收率(Y)分析双水相体系对人参皂苷的萃取效果,研究了PEG分子量、PEG/(NH4)2SO4质量分数、pH值和温度等因素对双水相成相及人参皂苷萃取的影响。结果表明:PEG分子量为3350、PEG3350的质量分数为12%、(NH4)2SO4质量分数为16%、溶液pH为7.0、温度为60℃时,双水相体系对人参皂苷有较高的萃取率,回收率可到达88.94%。     

双拷贝APP/BACE/DPsn转基因果蝇模型的建立及基因功能的研究

阿尔茨海默症 (Alzheimer′s disease, AD), 是一种以脑中β-淀粉样蛋白 (β-amyloid peptide, Aβ)沉积为主要病理改变的神经退行性疾病。在果蝇Drosophila模型中建立淀粉样蛋白前体蛋白 (amyloid precursor protein, APP)的剪切通路模拟Aβ的产生过程, 有望建立一种快速筛选治疗AD药物的动物模型。我们利用经典的Gal4/UAS系统, 将现有的APP/BACE/DPsn果蝇品系连续杂交, 通过同源重组的方法构建表达两个拷贝的APP/BACE/DPsn稳定可遗传的转基因果蝇新品系。进一步的实验结果表明： 与不表达APP/BACE/DPsn的对照果蝇w/y; APP/Cyo; BACE-DPsn/TM6BTb相比, 表达两拷贝APP/BACE/DPsn的 w/y; elav-APP; BACE-DPsn果蝇的最长寿命为52 d, 比对照组(69 d)缩短了17 d, 为对照组果蝇的75%; 中位生存时间为39 d, 比对照组(49 d)缩短了10 d, 为对照组的80%; 平均寿命为37 d, 比对照组(47 d)缩短了10 d, 为对照组的79%。同时, 表达两个拷贝APP/BACE/DPsn的果蝇所产卵的羽化时间比对照果蝇延长了3 d; 其羽化成虫的理论值为1∶9 (11%), 而实际羽化率仅为5.2%。结果提示, 由elav-Gal驱动在果蝇泛神经元内过表达APP/BACE/DPsn, 可以缩短果蝇寿命、 干扰果蝇胚胎正常发育。该果蝇有可能作为初步筛选AD治疗药物的动物模型, 为AD治疗新药的发现提供工具。