大豆疫霉菌的分离与鉴定

采用叶碟诱捕法从2007年进口的美国大豆携带的土壤和2006年从黑龙江感病大豆田采集的土壤中分离出2株疫霉菌菌株,并对病原菌进行了形态特征、致病性、分子检测。结果表明:形态观察为疫霉属真菌;接种大豆后出现典型的大豆疫病症状;采用大豆疫霉的特异性引物PCR检测,2个菌株均能扩增出分子量为330 bp的特异性条带。结合形态、致病性测定和分子检测,2株病菌鉴定为大豆疫霉菌(Phytophthora sojaeKauf-mann et Gerdemann)。     

汉坦病毒汉滩型特殊新亚型的发现

应用RT－PCR扩增了皖南山区分离株AH09的M和S片段全基因,克隆于T载体,纯化后测定序列。结果AH09株M片段的全基因序列共3625个核苷酸,编码1135个氨基酸;S片段的全基因序列共1724个核苷酸,编码430个氨基酸。M和S片段全基因核苷酸和氨基酸与汉坦病毒各型株的代表株和HTN型毒株的同源性比较表明,AH09株分枝与HTN型接近,与其它各型病毒则相距较远,故确定为HTN型毒株,但AH09株与HTN型毒株的M和S片段全基因序列有差异,其差异分别高达23．6％和20．4％,经种系发生分析,AH09株是迄今为止所发现的HTN型病毒中差异最大的新基因亚型病毒株,AH09株病毒M片段的氨基酸与HTN型相差13．5％至14．8％,而S片段仅相差7％－8．1％,说明AH09毒株的变异主要发生在M片段。而ORF和3‘端的NCR区核苷酸序列分析比较说明,病毒的变异更主要集中在该片段的3‘端的NCR区。     

活疫苗及其生产基质中Sendai病毒RT-PCR检测方法的研究

目的建立检测Sendai病毒的RT-PCR方法并应用于活疫苗及其生产基质中Sendai病毒的检测.方法将Sendai病毒E17株接种9日龄鸡胚尿囊腔,72h后收集尿囊液,用于提取病毒RNA,并逆转录成cDNA,用两对针对Sendai病毒NP基因设计的外引物和内引物分别进行扩增.扩增产物克隆于T-载体,并测序.尿囊液按10倍倍比稀释,进行敏感性实验.将该方法用于检测乙脑减毒活疫苗和用于生产疫苗用的普通级乳地鼠肾中的Sendai病毒.结果外引物和内引物的PCR分别扩增出684bp和248bp的片段,外引物PCR产物的测序结果与Genbank报告的序列完全一致.敏感性实验结果表明,第一次PCR可检测到10-4病毒滴度,巢式PCR可检测到10-7病毒滴度.乙脑减毒活疫苗和乳地鼠肾的检测结果为阴性.结论建立检测Sendai病毒的RT-PCR方法具有很高的特异性和敏感性.     

肾综合征出血热病毒Gou3株M片段的分子特性及序列的比较分析

为测定我国肾综合征出血热病毒Ｇｏｕ３株的Ｍ片段全基因序列,了解该株分子基础,并分析其瑟其他病毒株的差异,将提取的感染了病毒的Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞总ＲＮＡ进行逆转录ＰＣＲ扩增,产物直接或纯化后克隆Ｔ载体并测定序列,结果测得Ｇｏｕ３株Ｍ片段的全基因序列共３６５１个核苷 ,最大读码框架从４７到３４４８,共编码１１３４个氨基酸。     

流行性出血热(EHF)病毒半微量甲基纤维素空斑法的建立

本文报道EHF病毒一种新的空斑形成按术,即半微量甲基纤维素空斑法的建立及其应用。6株来源不同的毒株均可在V_(ero)-E_6细胞或V_(ero)细胞上形成清晰的空斑,形成的空斑能被特异抗EHF病毒血清所中和。其敏感性与用琼脂糖作覆盖物的空斑法一致。该法具有操作简便、快速等优点,适用于EHF的病原学和血清学研究。     

应用聚合酶链反应对我国不同来源肾综合征出血热病霉的型别分析

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）,对分离自不同地区、不同宿主来源的２６株肾综合征出血热病毒进行了分型,其中包括４个型别的国际标准株,用异硫氰酸胍－酚－氯仿方法从感染的Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞中提取总ＲＮＡ,设计了５对寡核苷酸引物,一对为汉坦病毒特异性引物;４对为不同型特异性引物。ＰＣＲ分型表明,２６株中除１株Ｒｒ可同时被汉坦（ＨＹＮ）和Ｓｅｏｕｌ（ＳＥＯ）两型特异性引物扩增外,其余２５株分别只被４个型别引物中的一个所扩增,依次为ＨＴＮ１６株,ＳＥＯ７株,Ｐｕｕｍａｌａ（ＰＵＵ）１株,ＰｒｏｓｐｅｃｔＨｉｌｌ（ＰＨ）１株。ＰＣＲ分型的结果与空斑减少中和试验完全一致,表明ＰＣＲ可以对肾综合征出血热病毒准成分型。应用限制性内切酶分析了扩增产物,结果与理论基本一致,证实了扩增产物的特异性。     

应用型特异性血清对肾综合征出血热毒株进行空斑减少中和试验分型

本文应用特异性出血热抗血清对国内外１４株出血热病毒进行空斑减少中和试验分型,结果不同毒株对两型持异性血清的中和效价大多相差８－１６倍,可以明显确定为出血热血清Ⅰ型或Ⅱ型。该方法用以出血热新分离株的分型不必制备分离株免疫血清,使鉴定更简便,并缩短时间。     

乙型脑炎病毒减毒中间株SA14-12-1-7基因组全序列的测定

本研究通过对乙型脑炎活疫苗减毒过程中间株SA14-12-1-7-12 -1-7株进行全序列测定和分析,进一步了解乙脑活疫苗减毒及其稳定性的分子机制.根据 已发表的SA14-12-1-7株及SA14-12-1-7株的序列,设计6对重叠引物,涵括整个乙脑病 毒的基因组,通过RT-PCR扩增出SA14-12-1-7-12-1-7株的各cDNA片段,分别克隆到pGEM -T载体,转化至TG1受体菌中,挑取阳性克隆进行鉴定后测序.结果表明SA14-12-1-7-12- 1-7株基因组全序列长10976个核苷酸,从96到10394为一个长开放读码框,编码3432个氨基 酸.与野毒株SA14-12-1-7和疫苗株SA14-12-1-7的核苷酸序列和氨基酸序列相比,同 源性均在99%以上,突变位点分散于各个区域,E区有5个位点与疫苗株一致而与野毒株不同 ,3个位点与野毒株一致而与疫苗株不同,推测与其容易产生回复突变、恢复毒力有关.此 外,NS3、NS5和3′NTR的几个位点可能与病毒毒力稳定性相关.综上所述,乙脑病毒减毒中 间株的基因组全序列基本类似于已发表的序列,若干突变位点影响病毒的弱毒性及毒力的稳定性.全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理具有重要意义.