人博卡病毒基因克隆及衣壳编码基因序列变异分析

为了解人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)VP1基因进化关系;阐明HBoV目前具体的变化规律,用PCR的方法扩增了1株HBoV的全基因和9株HBoV的VP1基因,克隆并测序,在此基础上,将HBoV的全基因序列和衣壳序列分别与细小病毒亚科其他14个有代表性的病毒进行遗传分析,构建进化树,对目前所有可得到的HBoV的17个衣壳蛋白进行二级结构分析和抗原性分析。结果显示:HBoV全基因序列与B19关系较远,但衣壳序列遗传关系较近。以有典型性的猫瘟细小病毒(Feline parvovirus,FPV)衣壳蛋白为参照,分析多个HBoV衣壳序列之间的变异情况,显示HBoV衣壳的二级结构基础表现出较高的保守性,序列之间的变化主要发生在高抗原区域和感染活性区域。衣壳病毒变异情况显示HBoV在稳定自身的情况下表现出一定的活跃性以逃避免疫反应,也表现出一定的感染适应力。     

轮状病毒vp8基因在原核系统中的初步表达

通过RT—PCR反应获得轮状病毒Wa株vp8基因的cDNA片段,将其克隆入pGEX—5X—1表达载体中,构建重组质粒pGEX—VP8,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆子并对插入片段vp8进行序列测定,诱导后通过SDS—PAGE检测重组蛋白,并观察表达量随时间变化的特征。结果显示,测序结果与vp8序列一致,VP8蛋白的表达量在诱导后6—8h达到高峰。     

利用寡核苷酸微阵列技术对HBV、HCV、HIV、HAV、GBV-C/HGV和B19进行同时监测的初步研究

探讨研制能同时检测HBV、HCV、HIV、HAV、GBV-C/HGV和B19的微阵列监控芯片。根据病毒公开发表序列,序列比对,得出保守区域,设计病毒的特异性检测探针,同时设置阴性、阳性参照探针,制备监控微阵列。利用随机引物PCR方法标记样品中的病毒靶序列,标记产物与微阵列上的探针杂交,清洗、扫描后进行结果分析。通过对质粒或模式分子的检测以及经HBV、HCV、HIV临床标本的验证,发现该微阵列监控芯片具有良好的特异性。其对质粒的检测灵敏度可达102病毒拷贝数,对临床标本的检测灵敏度可达103病毒拷贝数。此外,该微阵列监控芯片可检测出病毒混合感染血清。为微阵列监控芯片应用于此六种血液病毒的检测打下一定的基础。     

幽门螺杆菌尿素酶基因的研究进展

近年来,幽门螺杆菌的分子生物学研究取得了很大进展,而既是定植因子、又是毒力因子的幽门螺杆菌尿素酶也得到了更加深入的研究。本文就近年来幽门螺杆菌尿素酶基因的结构、转录、表达调控等方面一些新的研究进展作一综述。     

核糖体rDNA ITS序列在真菌学研究中的应用

rDNA序列的同源性和变化性使其用于真菌各级水平的系统学研究,其中ITS区进化速率较快、长度适中,广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究。该文就rDNA序列结构特点、ITS序列在真菌分子系统学及病原学中的应用等方面进行综述。     

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用

该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物,并在反转录酶和Bst-DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应,整个检测反应只需1~2h。利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因,对60份经Real-time PCR或RT-PCR验证阳性的血清样品检测,阳性符合率为98%。同时,对扩增终产物进一步进行酶切分析,并与HIV、HBV和不同亚型流感病毒RNA进行交叉反应和特异性测试,均与预期结果吻合。将Real-time PCR定量后的RNA系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示,该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA分子。以上结果证明,RT-LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。     

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测.该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应.对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green Ⅰ为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性.此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平.因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法.     

轮状病毒vp8基因在原核系统中的初步表达

通过RT-PCR反应获得轮状病毒Wa株 vp8基因的cDNA片段,将其克隆入pGEX-5X-1表达载体中,构建重组质粒pGEX-VP8,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆子并对插入片段vp8进行序列测定,诱导后通过SDS-PAGE检测重组蛋白,并观察表达量随时间变化的特征.结果显示,测序结果与vp8序列一致,VP8蛋白的表达量在诱导后6-8h达到高峰.     

G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6和NSP4编码基因的分子特征

最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚群为SGⅡ型,NSP4的基因型为B型。系统进化树分析表明,卢龙株LL36755的VP7、VP4编码基因与猪来源的毒株关系密切,而VP6、NSP4编码基因与人来源的毒株紧密相联系。可以推断新的人腹泻A组轮状病毒LL36755株是猪的VP7,VP4编码基因与人的VP6,NSP4编码基因的自然重组;而且该毒株不是G5的原型,很可能是人类轮状病毒与猪轮状病毒毒株的自然重组后逐步进化而来。     

流感病毒神经氨酸酶广谱抑制多肽的筛选研究

以纯化的流感病毒颗粒H1N1、H3N2为靶点对噬菌体展示的随机12肽库进行了筛选。经ELISA、神经氨酸酶抑制活性鉴定,获得52个阳性噬菌体克隆。根据测序和氨基酸序列分析,挑选出不同克隆间同源性最高的6条多肽进行化学合成。神经氨酸酶抑制活性实验显示,6条多肽中54-N1和69-N2的抑制活性最强,对N1、N2和乙型流感病毒三种流感病毒神经氨酸酶均有明显的抑制活性,54-N1的IC50值为7.486~14.693μmol/L,69-N2的IC50值为6.605~13.007μmol/L。同时,54-N1和69-N2可抑制流感病毒在MDCK细胞中的生长。病毒空斑抑制实验显示,54-N1和69-N2可明显抑制空斑形成的大小和数目。通过分析,54-N1的IC50值为18.38~31.76μmol/L,69-N2的IC50值为16.56~25.49μmol/L。两条多肽的浓度在高达10mmol/L时仍对细胞无任何毒性。54-N1和69-N2作为新的流感病毒神经氨酸酶抑制剂,与现有NA抑制剂Oseltamivir进行了比较和讨论,为进一步研制局部应用的广谱抗流感病毒的鼻腔喷雾剂奠定了基础。