一种切口平移法制备生物素标记核酸探针的简便方法

用切口平移法制备生物素标记的核酸探针,其所用试剂质量稳定、可靠,标记重复性好,且制备的探针易长期保存.我们在制备人IL-6 cDNA等基因探针的实验中,对常规的切口平移法制备生物素标记核酸探针的方法作了简化改进,省略了分离步骤,经斑点杂交试验证明效果良好.     

光钳操纵生物活体的动态监测技术的研究

采用摄像、录像和视屏监控系统及显色偏振装置与光钳系统耦合,从空间分辨、色分辨和时间分辨多方面改善系统品质,实现了光钳捕获与操纵生物活体的动态监测、实时记录、资料保存和屏幕再现的功能,并能测量光钳操纵细胞的位移量和由此计算操纵速度,提高了光钳的自我调整和光钳操纵细胞的精细度。本研究为激光光钳技术在细胞工程等方面的应用研究提供了行之有效的技术手段。     

虾钳菜披龟甲生物学的研究

虾钳菜披龟甲是湘南危害空心莲子草的重要害虫,1年发生4代,以成虫越冬。成虫产卵期长达25～45天,平均每雌产卵64粒。各虫态历期,因代别而异,卵期在3～9天,幼虫期在16～26天,蛹期3～8天。成虫寿命长达60天或200余天（越冬代）。发生为害与温、湿度关系密切,高温、干旱对其不利。     

原位缺口平移标记断裂DNA技术及其在检测流行性出血热尸检和实验动物组织中细胞凋亡和早期死亡的应用

原位缺口平移技术（ＩＳＮＴ）已被用于检测细胞核中ＤＮＡ断裂鉴别尸检组织中细胞的凋亡和坏死断裂、流行性出血热（ＥＨＦ）组织中存在散在单个细胞变性死亡和灶性梗死样坏死,前者带有细胞凋亡的特征。本文以ＥＨＦ肝脏和实验性病毒感染鼠脑组织为例,应用缺口平移法,在ＤＮＡ聚合酶或Ｋｌｅｎｏｗ酶的作用下,将地高辛标记的ｄＵＴＰ掺入合成到ＤＮＡ的断裂部位,通过碱性磷酸酶标抗地高辛抗体免疫组化法显示细胞ＤＮＡ的断裂,检测和鉴别细胞的凋亡和坏死。为分析死后解剖时间间隔及组织固定时间对该方法的影响,本文选用死后２～１４０ｈ尸检、经常规固定石蜡包埋后存放１０～３５年的标本和在１０％福尔马林固定了１０～３５年之后再进行常规处理的标本。实验时用蛋白酶Ｋ（ＰＫ）消化前后对比并分别在标记反应液中略去ＤＮＡ聚合酶作为阴性对照,用ＤＮＡ酶消化组织人为制造ＤＮＡ缺日作为阳性对照。结果发现,未经ＰＫ消化的组织,仅灶性肝细胞核ＩＳＮＴ标记阳性,经ＰＫ消化后,散在的带有凋亡特征的肝细胞胞核也出现阳性,灶性肝细胞胞核标记染色增强,但无论是蛋白酶消化与否,明确梗死样坏死的肝细胞均不被标记。结果还发现,死后２～２４ｈ内尸检组织和长时间（１０～３４年）存放的石     

戊吡虫胍对棉铃虫中枢神经细胞电压门控钙通道和钾通道的影响

【目的】戊吡虫胍是将新烟碱类和缩氨脲类杀虫剂杀虫活性部分重新组合的新型杀虫剂。但对于该类杀虫剂究竟如何影响离子通道,通道门控特性和功能是如何变化目前尚未见报道。本实验旨在明确该杀虫剂是否影响电压门控钙通道和钾通道的门控过程,探究其是否为该杀虫剂的潜在作用靶标。【方法】应用全细胞膜片钳技术检测戊吡虫胍对棉铃虫Helicoverpa armigera Hübner中枢神经细胞电压门控Ca~(2+)通道和K~+通道的影响。【结果】戊吡虫胍作用后Ⅰ-Ⅴ曲线和激活曲线均向超极化方向移动10-15 mV,具有显著性统计学差异(P0.05)。稳态失活曲线向超极化方向移动约5 mV,不具有统计学差异(P0.05)。电压门控Ca~(2+)通道峰值电流(I_(peak))有不同程度的降低。随着浓度增大I_(peak)降低有减小的趋势。此外,1μmol·L~(-1)戊吡虫胍作用后钙离子的窗口电流(I_w)面积增加幅度较10μmol·L~(-1)和100μmol·L~(-1)大,为93.20%。提示在一定的测试电压下,该药物作用后处于激活状态的Ca~(2+)通道数目增多。另外,其作用后电压门控钾通道I_(peak)降低。随着浓度增大I_(peak)降低有减小的趋势。同时Ⅰ-Ⅴ曲线下移,激活曲线向去极化方向移动约8 mV,不具有统计学差异(P0.05)。这表明戊吡虫胍作用后K~+通道在较高电位下才能激活。【结论】戊吡虫胍能够有效抑制Ca~(2+)通道和K~+通道I_(peak),并使通道的激活曲线和失活曲线发生移动,影响Ca~(2+)通道和K~+通道的门控特性。表明棉铃虫中枢神经细胞上的电压门控Ca~(2+)通道和K~+通道是戊吡虫胍的潜在作用靶标之一。     

亚致死浓度溴虫腈和毒死蜱对等钳蠊螨生长繁殖和解毒酶的影响

【目的】害虫综合治理中,化学防治对天敌资源也具有一定的杀伤力。为缓解这一矛盾,本研究旨在探究溴虫腈和毒死蜱亚致死浓度处理对等钳蠊螨Blattisocius dentriticus生长繁殖及解毒酶活性和基因表达量的影响。【方法】利用药膜法处理2-3日龄等钳蠊螨成螨24 h,测定溴虫腈和毒死蜱的亚致死剂量;测定和比较LC_(10)和LC_(30)剂量这两种药剂处理后F_0和F_1代的产卵量、产卵期、卵孵化率和雌成螨寿命等生物学特性的变化;通过酶活力分析和RT-PCR分别测定LC_(10), LC_(30)和LC_(50)剂量下这两种药剂处理后钳蠊螨成螨体内谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)、细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)、羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)酶活力及其基因表达量变化。【结果】溴虫腈和毒死蜱处理24 h对等钳蠊螨成螨的LC_(50)分别为42.56 mg/L和72.42 mg/L。溴虫腈和毒死蜱LC_(10)和LC_(30)剂量处理等钳蠊螨雌成螨后,与对照(清水处理)相比,仅F_0代雌成螨寿命和产卵期显著缩短(P0.05),而产卵量和卵孵化率无明变化。酶活力测定结果发现,GST, CYP450和CarE的活力在溴虫腈和毒死蜱LC_(10)和LC_(30)剂量处理后无明显变化,而LC_(50)剂量下,上述3种酶的活力均显著增加(P0.05)。基因表达结果表明,溴虫腈LC_(10), LC_(30)和LC_(50)剂量处理下2个GST基因(BdGST3和BdGST6)、3个CYP450基因(BdCYP2-4)和5个CarE基因(BdCarE1-5)表达均显著上调;在毒死蜱这3个剂量处理下3个GST基因(BdGST1,BdGST3和BdGST4)、3个CYP450基因(BdCYP2,BdCYP5和BdCYP6)和2个CarE基因(BdCarE1和BdCarE2)表达量均显著上调。【结论】结果表明,LC_(10)和LC_(30)剂量的溴虫腈和毒死蜱亚致死剂量会抑制F_0代雌成螨的生长繁殖;LC_(10), LC_(30)和LC_(50)剂量下这两种药剂可诱导等钳蠊螨GST, CarE和CYP450基因表达;LC_(50)剂量能明显诱导等钳蠊螨体内GST, CarE和CYP450活性上升。该研究为等钳蠊螨抗性品系的筛选及田间应用提供了理论依据。     

自发性高血压大鼠和Wistar大鼠脑动脉平滑肌细胞膜电流的比较

目的:探讨自发性高血压大鼠(SHR)和Wistar大鼠脑动脉(BA)平滑肌细胞膜电流的异同。方法:应用全细胞膜片钳技术研究SHR和Wistar大鼠BA平滑肌细胞在电流密度、电流组成以及自发性瞬时外向K+电流(STOCs)特性的异同。结果:①当指令电压为0、+20、+40和+60mV时,SHR与Wistar大鼠BA平滑肌细胞间电流密度存在统计学差异(P<0.01)。②SHR与Wistar大鼠BA平滑肌细胞膜电流都对1 mmol/L电压依赖的K+通道(Kv)阻断剂4AP和1 mmol/L大电导Ca2+激活K+通道(BKCa)阻断剂TEA敏感。③SHR的STOCs发放频率和电流幅度都远大于Wistar大鼠。1 mmol/LTEA基本完全阻断STOCs通道电流,而4-AP对STOCs没有影响。结论:SHR和Wistar大鼠脑动脉平滑肌细胞的电流密度存在差异,两种平滑肌细胞外向电流都由BKCa和Kv通道组成。SHR大鼠平滑肌细胞更易诱发由BKCa通道介导的STOCs。     

适用于磁压榨吻合的平移钳的设计

目的:提出了磁压榨吻合操作中可用于磁体夹持固定的平移钳的结构设计方案。方法:分析本团队多种原创性磁压榨吻合技术操作中存在的缺陷和不足,认为目前磁压榨吻合操作中依靠术者徒手控制或利用现有血管钳对磁体进行夹持和固定,是造成操作中诸多不便的主要原因。从力学角度分析了常规血管钳夹持磁体易导致磁体滑脱的原因,指出设计加工磁吻合专用钳是解决目前磁吻合操作不便的有效措施。在此基础上提出了利用平移钳来固定磁体的结构设计方案,并从力学角度进行了受力分析,设计出了用于磁压榨吻合操作中磁体夹持固定的平移钳。结果:平移钳的结构设计能够稳定夹持磁体,避免磁体滑脱;同时,借助齿轮传动结构控制钳头的平行移动能够更好地控制磁体的精准对吸和分离,可进一步简化操作,避免副损伤,节省手术操作时间。结论:平移钳能满足多种形状及大小的磁体的夹持和固定,可有效控制磁体的吸合与分离,极大地方便操作。该平移钳加工简单,使用方便,有助于推动磁压榨吻合技术在临床广泛开展。     

血管紧张素Ⅱ对模拟缺血心室肌细胞L-型钙通道的影响

实验研究了血管紧张素II（AngⅡ)对模拟缺血心室肌细胞L－型钙离子通道的作用,用胶原酶酶解法急性分离豚鼠心室肌细胞,以全细胞膜片钳方法记录心室肌细胞的L－型钙电流（ICa L.)。采用低氧,无糖,高乳酸和酸中毒综合方式模拟缺血液灌流,造成心室肌细胞的模拟缺血,并在缺血的基础上继续用含100mmol/A AngⅡ灌流细胞,观察AngⅡ对模拟缺血心室肌细胞钙离子通道的影响,实验结果显示,模拟缺血时ICa.L峰值电流明显减小,最大激活电压为0mV,AngⅡ能抵抗模拟缺血对ICa,L的抑制效应,使ICa,L峰值电流增大,并使最大激活电压左移至－10mV。     

用突起切断法分析MPP+对于多巴胺能神经细胞的损伤

对神经细胞在电压钳制方式下进行膜片钳记录受到胞体和突起空间钳位不一致的限制。本文尝试用突起切断方法区分胞体与突起的电压门控型钙电流,并据此对ＭＰＰ＋引起的钙电流变化进行分析。实验结果表明,突起上的电压门控钙通道的最大激活电压约为＋３０ｍＶ,而胞体的则为－１０～１０ｍＶ左右;ＭＰＰ＋损伤多巴胺能神经细胞后可导致电压门控型钙电流的抑制,这一抑制的Ｉ－Ｖ特性与突起钙电流Ｉ－Ｖ非常相近。由此提示,ＭＰＰ＋对于多巴胺能神经细胞的损伤更集中于其突起纤维。