Ⅰ型超敏反应免疫疗法的研究进展

Ⅰ型超敏反应疾病,特别是变应性鼻炎、哮喘和食物过敏等,在全球儿童和青年中呈逐年增加趋势。大多数患者通过避免过敏原接触、接受传统的变应原特异性免疫疗法(allergen-specific immunotherapy, AIT)及对症药物治疗,病情都能得到一定程度的控制;但少数患者仍然有持续的症状,处于有生命威胁的过敏反应风险中。探索Ⅰ型超敏反应的免疫新疗法(novel immunotherapy)和开发传统AIT新技术成为提高临床疗效的主要策略。现依据固有免疫和适应性免疫机制,对这两个方向的研究进展作一概述。     

用于变应原疫苗分析和质控的实验技术

建立和应用一种可靠的质量分析方法是所有生物制品质量和工艺一致性的保障。一种准确反应药物中特异组成成分的活性和结构,并且优化和验证了的方法,是所有生物医药领域研发和新药上市的一个核心目标。变应原疫苗是天然物质的混合物,每一种变应原疫苗含有多种活性成分和与变应原无关未知的非活性成分,其中,具有变应原活性的物质只占一小部分,而且主要变应原成分作用在患者与患者之间差异性很大。本文介绍了一种变应原疫苗分析和质控的方法,包括变应原疫苗总蛋白含量、总蛋白组分、主要致敏蛋白组成、主要致敏蛋白含量、总生物活性几方面。     

特异性免疫不同方式给药治疗变应性鼻炎的临床效果观察

目的:研究特异性免疫不同方式给药治疗变应性鼻炎的临床效果及安全性。方法:选取2013年4月-2015年4月我院收治的80例变应性鼻炎患者为研究对象,按照给药方式的不同分为对照组与观察组,对照组给予变应原疫苗皮下免疫治疗,观察组给予变应原滴剂舌下免疫治疗,比较两组患者的治疗效果、症状积分、体征积分、RQLQ评分的改善情况与不良反应的发生情况。结果:观察组患者治疗1年后症状积分、体征积分、RQLQ评分均显著低于对照组(P0.05),但总有效率显著高于对照组(P0.01),两组患者均无严重不良反应发生,对照组患者局部不良反应的发生率明显高于观察组(P0.01)。结论:采用皮下免疫法对变应性鼻炎的治疗效果明显优于舌下免疫治疗,可有效控制患者症状和体征,且安全性更高。     

红星梭子蟹变应原原肌球蛋白基因的克隆、表达及其免疫学鉴定

克隆、表达红星梭子蟹蟹肉中变应原原肌球蛋白（Tropomyosin）,并对其免疫学特性进行鉴定。RT-PCR克隆红星梭子蟹（Portunus sanguinolentus）蟹肉中变应原原肌球蛋白的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增蟹Tropomyosin的完整开放阅读框,与pET-28a载体连接并转化大肠杆菌Escherichia. coli BL21(DE3),诱导表达后,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,Western-blot检测其免疫学活性,胰酶消化后进行MALDI-TOF-MS质谱分析鉴定。克隆所得蟹Tropomyosin基因包括一个编码285个氨基酸的开放阅读框。序列分析结果显示所克隆得到的基因与已知虾、螨、蟑螂等的Tropomyosin变应原基因有较高的同源性（>80%）。根据变应原的命名规则,将其命名为Pors 1,并提交GenBank数据库,登录号为EF143836。重组蟹Tropomyosin在大肠杆菌中能高效的表达,表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化后进行Western-blot检测,结果显示该重组蛋白具有良好的免疫学活性,MALDI-TOF-MS质谱分析进一步证实了该重组变应原的正确性。本研究成功克隆和表达了红星梭子蟹变应原Tropomyosin,为蟹过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

粉尘螨变应原第7组分全长基因序列测定与分析

目的：获得粉尘螨变应原第7组分编码基因并了解其分子特征。方法：根据GenBank已公布的Derf7核酸序列设计引物,用RT—PCR扩增获得其编码基因,插入pMD19-T载体进行序列测定和生物信息学分析。结果：获得Derf7全长基因约642bp,与参考序列（GenBankAY283292）同源性达99．7％％,仅在249位”A→G”和439位“C→T”发生点突变,含1个完整的开放读码框。推测编码蛋白由213个氨基酸组成,信号肽序列位于1-17aa,亲水性指数为0．031,跨膜区域位于171—190aa,二级结构由一螺旋（57．28％）、延伸主链（6．57％）和无规卷曲（36．15％）组成;亚细胞定位于细胞质,含有N-糖基化位点1个（151-154aa）,蛋白激酶c磷酸化位点1个（193-195aa）,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点2个（155—158aaand173．176aa）。N端酰基化位点1个（97—102aa）。粉尘螨和屋尘螨变应原第7组分氨基酸序列相似度为86％,二者在螨类第7组分氨基酸序列构建出的分子进化树中聚成一簇。结论：获得了Derf7全长基因,为进一步获得其基因工程制品用于临床和实验研究奠定了基础。     

蜂毒变应原及蜂毒免疫治疗

膜翅目昆虫种类繁多,其中某些种类昆虫刺蛰后可以导致严重的甚至危及生命的过敏反应。目前,关于膜翅目毒液的成分和变应原的研究越来越广泛和深入。该文主要介绍膜翅目中蜜蜂毒液的主要成分、主要变应原及蜂毒过敏的免疫治疗。     

家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

对家蝇变应原原肌球蛋白(Tropomyosin)基因进行同源克隆,序列分析;构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从家蝇幼虫cDNA文库中筛选获得Tropomyosin基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板,进行PCR扩增,获得家蝇Tropomyosin完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒,转化到大肠杆菌OrigamiB(DE3)中进行诱导表达。Tropomyosin基因ORF全长828 bp,编码275个氨基酸,理论分子量31.6 kD;等电点为4.65,具有Tropomyosin家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达pEASY-E1-Tropomyosin并诱导表达重组蛋白。     

美洲大蠊Per a7基因的克隆、表达及免疫学鉴定

根据原肌球蛋白基因序列设计引物,以我国南方地区美洲大蠊Periplaneta Americana RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出852 bp的全长编码片段,经序列分析发现该基因与NCBI公布的Per a7有3个核苷酸发生改变。将目的片段克隆到pET24a(+)表达载体中,在大肠杆菌BL21 Star获得表达,融合蛋白的分子量约为33 kD。利用蟑螂过敏性患者血清对表达产物进行Western blotting检测,出现明显的识别条带,说明表达产物具有IgE结合活性。     

美洲大蠊主要变应原蛋白的质谱鉴定与分析

为了建立美洲大蠊Periplaneta americana变应原蛋白的质谱鉴定方法,我们将美洲大蠊粗浸液通过DEAE-52离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析等分离步骤得到纯化的74 kD蛋白,对纯化前后的该74 kD蛋白分别进行SDS-PAGE及凝胶内胰酶酶切,再经液相色谱-电喷雾-串联质谱（HPLC-ESI-MS/MS）在线联机分析,所得质谱数据进入网站（http://www.matrixscience.com）进行Mascot检索比对。通过对两者质谱鉴定结果的比较来评估美洲大蠊天然主要变应原蛋白的纯化效果。结果表明,纯化蛋白经HPLC-ESI-MS/MS鉴定是美洲大蠊主要变应原蛋白;离子交换层析等纯化步骤可以去除同一分子量的杂蛋白(如卵黄原蛋白),从而获得较好的鉴定结果。我们首次成功地运用质谱建立起变应原蛋白的新鉴定方法。     

美洲大蠊变应原Pera2的生物信息学分析

目的:了解美洲大蠊变应原Per a 2的分子生物学特征。方法:从Genbank中获得Per a 2的核酸序列,用ExPaSy、EBI和NCBI网站的在线软件推导出编码氨基酸序列及其理化性质、空间结构、功能位点,并在Blastp比对后选择不同物种同源序列计算相似率、构建分子进化树。结果:Pera2由351个氨基酸细戍,分子量为38119Da、等电点为4.90、分子式为C1217H1825N285O297S18,为细胞外疏水性蛋白、属于肽酶a家族,信号肽位于1～20氨基酸处,三个跨膜螺旋区域依次位于1～19aa、51～78aa、282～300aa处;二级结构由α-螺旋(9.4%)、β延伸(28.49%)、随机线圈(62.11%)组成;美洲大蠊和德国小蠊相似率为55%、与马德拉蜚蠊相似率为51%,三者在Pera2与不同物种的同源序列构建的分子进化树中聚成一簇。结论:通过对Per a 2的生物信息学分析获得了该变应原分子特征,为进一步研究奠定基础。