木犀草素通过调节凝血活性物质及凝血因子含量维持机体血液循环功能的稳定

目的探讨木犀草素通过调节凝血活性物质及凝血因子含量维持机体血液循环功能的作用机制。方法采用试剂盒和试管法测定木犀草素作用后的凝血酶原时间和血浆复钙时间;采用酶联免疫吸附法检测木犀草素对血液凝血活性物质血栓素(TXB2)、纤维酶原激活物抑制剂(PAI-1)、促红细胞生成素(EPO)和凝血因子Ⅶ(FⅦ)、凝血因子Ⅸ(FⅨ)含量的影响;采用PCR法测定木犀草素对凝血因子Ⅶ、Ⅸ的基因表达情况。结果木犀草素能缩短凝血酶原时间和血浆复钙时间,与对照组相比,40 mg/kg的木犀草素使凝血酶原时间和血浆复钙时间分别降低62.89%和64.05%(t=8.713 6、6.218 1,均P0.000 1),表明木犀草素能够促进机体的凝血功能,从而调节血液循环。酶联免疫结果显示,木犀草素能提高小鼠凝血活性物质TXB2、PAI-1和EPO的含量,与对照组相比,40 mg/kg木犀草素能使其含量分别提高11.94%(t=-7.638 0,P=0.000 3)、80.75%(t=-21.698 4,P0.000 1)和26.15%(t=-9.610 4,P=0.000 2),表明木犀草素可通过促进血小板的凝集、纤维酶原的活化以及增加血液的黏度来维持机体血液循环功能的稳定。木犀草素也能提高凝血因子Ⅶ和Ⅸ的含量及其基因表达量,与对照组相比,40 mg/kg的木犀草素能使凝血因子Ⅶ和Ⅸ的含量分别提高290.86%(t=-16.369 1,P=0.000 1)和374.52%(t=-8.104 2,P=0.001 2),基因表达量分别提高172.73%和224.63%(t=-22.007 5、-31.198 6,均P0.000 1),表明木犀草素可通过调节凝血因子Ⅶ和Ⅸ的表达量促进机体凝血,维持机体血液循环功能的稳定。结论木犀草素具有维持机体血液循环功能稳定的作用,其作用机制是通过提高凝血活性物质的含量,调节凝血因子的基因表达量,提高凝血因子的含量,以及抑制纤维酶原的激活和增加血液的黏度等多方面综合作用来实现的。     

人体位改变对凝血因子某些因素水平的影响

目的 :探讨不同体位对凝血因子检测的影响 ,给循证医学和凝血因子检测全面质量控制提供实验室证据。方法 :1 0 5名志愿者经同体配对试验 ,在不同季节分批抽取不同体位、不同时间、同一部位血液 ,在全自动凝血分析仪上与质控品同批分析疑血因子 5项指标。结果 :以卧位为基线与坐位相比 ,各项指标平均改变 7.0 7% ,多者9.33 % ,差别非常显著 (P <0 .0 0 1 )。根据变化百分数大小依次为 :纤维蛋白原 (FIB) ,凝血酶时间 (TT) ,活化部分凝血活酶时间 (APTT) ,凝血酶原时间 (PT) ,国际标准化比值 (INR)。其中FIB、TT、APTT结果升高 ,呈正相关 (r>0 .97) ,而PT、INR则下降 ,呈负相关。改变体位 1 5min内 ,各参数平均恢复到原体位的 95 .2 %。季节、年龄和仪器差别不影响本实验。结论 :人体位改变能引起凝血因子显著生理变异     

酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子Ⅷ转基因表达

最近的研究表明,蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ (BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌,而且剪接反应在细胞内、外均可发生．为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效,将具有促进重链分泌作用的位于Pro¹⁶⁴⁰～Ser¹⁶⁹⁰的酸性区3(acidic region-3,AR-3)引入重链,检验对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响．用融合蛋白内含子的附加ar-3重链(HCAR3IntN)基因和轻链(IntCLC)基因共转染培养的HEK293细胞,分别用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性,并用免疫印迹观察了细胞内的BDD-FⅧ剪接．结果显示,共转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞,分泌至上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性分别为(173±26) μg/L和(1.31±0.15) U/ml,明显高于未添加ar-3的蛋白质内含子融合重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)基因共转染细胞[(102±12) μg/L和(0.79±0.09) U/ml],提示AR-3对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性有明显改善作用．而且,分别转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中,亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和活性[(35±7) μg/L和(0.28±0.08) U/ml],表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接．另外,转基因细胞总蛋白呈现明显的可与FⅧ多克隆抗体进行反应的剪接BDD-FⅧ蛋白条带,直观地反映细胞内BDD-FⅧ的剪接．为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术的双腺相关病毒载体(AAV)转BDD-FⅧ基因实验提供了依据．     

冻干加热处理凝血因子类制剂的病毒灭活验证

在病毒灭活验证过程中,比较了冻干后不同加热方法对凝血因子类制剂中伪狂犬病毒(PRV)的灭活效果,包括80℃干烤72h、100℃水浴加热30min以及100℃蒸汽加热30min方法。结果表明80℃干烤72h对制品中PRV灭活较彻底,另外两种方法对制品中PRV的灭活效果均不理想。     

重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

采用定点诱变技术, 将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因, 并构建于AAV载体上, 以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒, 然后, 经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验, 观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果. 结果显示: (i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在, 并持续15周以上; (ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%, 显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%); (iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在; (iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用. 提示: 以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFIX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.     

重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子IX高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

采用定点诱变技术,将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因,并构建于AAV载体上,以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒,然后,经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验,观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果.结果显示:(i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在,并持续15周以上;(ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%,显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%);(iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在;(iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用.提示:以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFLX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.     

凝血因子药物市场分析

凝血因子是一类特殊的药物,是血友病等血液疾病的治疗药物,目前已经成为血液制品的重要组成部分。国外已经有二十多种重组凝血因子药物上市,2015年全球重组凝血因子药物的市场规模已经达到78.54亿美元,未来还将持续增长,Baxalta公司的重组凝血因子产品销售额位居全球首位,达到28.40亿美元。国外有多种重组凝血因子处于研发阶段,其中长效重组凝血因子将成为新的市场增长点。国内各类凝血因子药物的批签发状况良好,且随着国家发展和改革委员会取消血液制品最高零售价,各类产品价格均有不同幅度增长,其中人纤原蛋白原增长幅度最高,达到189%。国产凝血因子市场空间巨大,但存在产品供给和研发力度不足等问题,发展受到限制,必须改革行业管理制度、提高血浆分离技术、加强重组产品研发。     

人凝血因子Ⅸ突变型研究现状

血友病B是一种性连锁隐性遗传病,其发病机制是位于X染色体上的人凝血因子Ⅸ(hFIX)基因发生了突变,导致血浆中hFIX含量或活性大幅下降,从而使得内源性凝血途径受到阻碍,无法进行正常的凝血.文章综述了hFIX基因及其编码蛋白质的结构和功能,并分类详细论述了血友病B中发现的几种主要突变类型.其中包括奠基者效应造成的突变、调控区的突变、编码区的突变、内含子剪切位点的突变及另外两种较为特殊的突变,同时介绍了这些突变所造成的生物学效应.最后还简要介绍了一种能提高hFIX蛋白凝血活性的突变类型(第338位Arg→Ala),并对其应用作了展望.     

两种虎纹捕鸟蛛昆虫毒素的分离纯化及生物学活性鉴定

结合离子交换和反相高效液相色谱从虎纹捕鸟蛛粗毒分离纯化到 2种虎纹捕鸟蛛毒素 ,命名为虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅶ和虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅷ .经质谱测定这 2种毒素的分子量分别为 3981 0 2和 4 171 12 .氨基酸序列分析发现 ,这 2种虎纹捕鸟蛛毒素同源性非常高 ,只有 6个残基位点的不同 .虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅶ和虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅷ的生物学功能相似 ,都能对蝗虫起到麻痹作用 ;对小鼠的中枢神经作用高剂量能使小鼠产生致死 ,但低剂量虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅷ能使小鼠产生惊厥反应 ,而低剂量虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅶ不能使小鼠产生惊厥反应 ;这 2种毒素都能阻断小鼠离体膈神经膈肌的神经肌肉传递 ,且与虎纹捕鸟蛛毒素 I混合后都具协同作用