酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子Ⅷ转基因表达

最近的研究表明，蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ (BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌，而且剪接反应在细胞内、外均可发生．为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效，将具有促进重链分泌作用的位于Pro¹⁶⁴⁰～Ser¹⁶⁹⁰的酸性区3(acidic region-3，AR-3)引入重链，检验对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响．用融合蛋白内含子的附加ar-3重链(HCAR3IntN)基因和轻链(IntCLC)基因共转染培养的HEK293细胞，分别用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性，并用免疫印迹观察了细胞内的BDD-FⅧ剪接．结果显示，共转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞，分泌至上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性分别为(173±26) μg/L和(1.31±0.15) U/ml，明显高于未添加ar-3的蛋白质内含子融合重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)基因共转染细胞(102±12) μg/L和(0.79±0.09) U/ml]，提示AR-3对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性有明显改善作用．而且，分别转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中，亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和活性(35±7) μg/L和(0.28±0.08) U/ml]，表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接．另外，转基因细胞总蛋白呈现明显的可与FⅧ多克隆抗体进行反应的剪接BDD-FⅧ蛋白条带，直观地反映细胞内BDD-FⅧ的剪接．为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术的双腺相关病毒载体(AAV)转BDD-FⅧ基因实验提供了依据．