体外诱导人脐带间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化

该研究旨在通过条件培养基诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)向II型肺泡上皮细胞(type II alveolar epithelial cells,AEC2s)分化,为后续研究h UC-MSCs来源的AEC2s在肺部疾病中的治疗作用奠定基础。h UC-MSCs分为实验组和对照组,实验组用小气道上皮细胞生长基础培养基培养2天后添加生长因子诱导培养,对照组用20%血清的DMEM/F12培养。第14天观察细胞形态;Western blot、免疫荧光、流式细胞术和ELISA法检测肺泡表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)及前肺泡表面活性蛋白C(pro-surfactant protein C,pro SP-C)。利用透射电镜观察板层小体。结果显示,实验组细胞形态由长梭形向多边形转变,细胞内有pro SP-C表达,培养基上清中有SP-C分泌,透射电镜观察到板层小体;而对照组细胞形态无明显改变,未检测到pro SP-C表达、SP-C分泌和板层小体形成。该研究结果表明,体外诱导培养可促进h UC-MSCs向AEC2s分化,通过该方法有望大量获得h UC-MSCs来源的AEC2s用于肺部疾病治疗研究。     

尿源性干细胞移植修复慢性肝损伤裸鼠肝脏功能

该研究探讨尿源性干细胞(urine-derived stem cells, USCs)的生物学性状及移植治疗慢性肝损失模型的可能。分离培养USCs,观察细胞形态、流式细胞术检测干细胞表面标记,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色、茜素红染色、油红O染色、ICG(indocyanine green)摄取实验、PAS(periodic acid-Schiff)染色等评估其成骨、成脂和成肝分化。建立四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)诱导的慢性肝损伤模型,尾静脉4次移植USCs,计算肝脏指数,检测血清ALT、AST, HE及Masson染色,评估治疗效果。结果表明, USCs为米粒状贴壁生长细胞,表达多种间充质干细胞标志物:CD24、CD29、CD73、CD90和CD105,表达细胞周期表面标志物CD146,不表达造血细胞表面标志物CD31、CD34、CD45。成骨成肝诱导的USCs后ALP染色、茜素红染色、油红O染色阳性,单纯成肝诱导后几乎无ICG摄取及PAS染色阳性的细胞,而与肝干细胞共培养的USCs诱导组中,约10%细胞有ICG摄取及PAS染色阳性。与模型组相比, USCs移植组肝脏指数显著降低, ALT、AST降低但无统计学意义,肝细胞退行性变及纤维增生明显改善。该研究成功分离培养出增殖能力强并具有多向分化潜能的USCs,移植入慢性肝损伤裸鼠,可在一定程度上修复肝脏损伤。     

BMP9诱导人脐带间充质干细胞体内外成骨分化的作用研究

目的:探讨人骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)在体内外诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)成骨分化的作用研究。方法:设立Ad-BMP9处理组和Ad-GFP对照组感染hUC-MSCs,两组细胞分别于3天、5天、7天进行ALP活性检测,14天后采用免疫组织化学染色检测骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(Osteopotin,OPN)的表达情况,21天后茜素红染色检测矿化结节的形成;然后收集不同分组hUC-MSC用于裸鼠皮下注射成骨模型的建立,4周后取出离体骨进行Micro-CT扫描和分析,并进行H&E、Masson Trichrome、Alcain Blue染色。结果:BMP9处理组的ALP活性和矿化结节形成明显高于对照组,免疫组化染色结果显示BMP9诱导组的OCN、OPG的阳性表达明显高于对照组;裸鼠皮下注射成骨模型的观察结果显示,空白对照组没有形成肉眼可见的皮下包块,仅感染Ad-BMP9的hUC-MSCs能生成异位骨,且形成的异位骨骨量明显,骨密度平均值为396.05±0.60;H&E染色结果显示BMP9诱导生成的异位骨中形成部分成熟的骨基质和骨小梁,Masson Trichrome染色结果显示BMP9明显诱导hUC-MSCs的基质矿化作用,Alcain Blue染色结果显示BMP9明显诱导hUC-MSCs的软骨内成骨作用。结论:BMP9成功诱导人脐带间充质干细胞的体内外成骨作用,为临床骨组织工程的细胞疗法提供了明确的可行性。     

α-硫辛酸增强人脐带间充质干细胞免疫抑制作用的实验研究

核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2)是细胞抗氧化应激的关键分子,激活NRF2可以有效逆转干细胞的衰老表型。该文主要研究NRF2激动剂α-硫辛酸(α-lipoic acid, ALA),增强脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)免疫抑制能力。培养第5代和第18代的UC-MSCs,通过β-gal染色、CCK-8及免疫荧光检测细胞增殖能力和衰老表型。Western blot检测衰老相关蛋白p16以及NRF2信号通路相关分子NRF2、Ser40磷酸化的NRF2(pS40-NRF2)蛋白表达。qRT-PCR检测细胞免疫调节抑制因子吲哚胺-2,3-双加氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1, IDO-1) mRNA表达水平的差异,流式细胞术检测UC-MSCs抑制外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)增殖能力的差异。结果显示, UC-MSCs在体外长期扩增过程中增殖能力降低并表现出衰老表型; Western blot检测NRF2及pS40-NRF2蛋白表达降低; IFN-γ依赖的IDO-1的mRNA表达水平显著降低,抑制PBMC增殖能力下降。ALA作用后β-gal染色阳性细胞数量减少并促进细胞增殖; IDO-1的mRNA表达增加以及抑制PBMC增殖的能力增强。该研究结果提示, ALA可以延缓UC-MSCs的衰老,并增强其免疫抑制能力。     

机械敏感离子通道Trpm7在LIPUS促进牙髓间充质干细胞成骨分化中的作用机制的研究

该文主要研究低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)促进牙髓间充质干细胞(dental pulp mesenchymal stem cells,DPSCs)成骨分化,以及瞬时受体电位M7(transient receptor potential melastatin 7,Trpm7)在其中发挥的作用。培养人DPSCs,流式细胞术检测其表面分子标志表达,阿利新蓝、茜素红及油红O染色检测其成软骨、成骨和成脂分化能力。ALP活性、ALP染色和茜素红染色观察LIPUS促成骨分化的能力。实时定量PCR检测LIPUS处理组与对照组成骨分化相关基因OPN、OCN、RUNX2表达的差异以及不同时间点两组Trpm7 m RNA表达水平的变化。ALP活性检测LIPUS及不同浓度Trpm7抑制剂2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)对成骨分化能力的影响。实验分为对照组、LIPUS组、LIPUS+二甲基亚砜(DMSO)组和LIPUS+2-APB组,ALP和茜素红染色观察各组成骨分化能力,Western blot检测各组OPN、OCN和RUNX2的蛋白表达。结果显示,成功培养DPSCs,LIPUS处理后ALP和茜素红阳性染色明显增多,ALP活性增强(P0.01);OPN、OCN、RUNX2的m RNA表达水平显著增加(P0.05),LIPUS处理第2天和第5天Trpm7的m RNA表达水平有明显升高(P0.05)。2-APB作用后明显下调ALP活性(P0.01)。LIPUS组、LIPUS+DMSO组与对照组相比,ALP和茜素红阳性染色以及OPN、OCN与RUNX2的蛋白表达均显著增加,而LIPUS+2-APB组较于LIPUS+DMSO组,ALP和茜素红染色以及OPN、OCN与RUNX2的蛋白表达明显降低。该研究结果提示,LIPUS能够促进DPSCs的成骨分化,且Trpm7在这一过程中发挥着重要作用。     

全反式维甲酸调控自噬促进肝祖细胞成熟分化的作用研究

该研究探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)体外诱导小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞成熟分化及ATRA对细胞自噬水平的调控作用。应用1μmol/L ATRA处理小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞,不同时间点进行荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性,Real-time PCR检测肝细胞相关标志基因的表达,吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)及过碘酸–希夫(periodicacid-schiff,PAS)染色检测细胞的成熟功能;透射电镜观察自噬体及细胞连接,ptf LC3质粒转染细胞,激光共聚焦显微镜观察自噬流,Western blot检测自噬相关标志蛋白质水平等综合分析自噬的变化情况。结果显示,与对照组相比,ATRA可显著增强HP14-19细胞ALB-Gluc活性,抑制肝前体细胞标志DLK和AFP的表达,促进成熟肝细胞标志ALB、CK18、TAT和Apo B的表达,ICG及PAS染色阳性细胞数显著增多(P0.05);透射电镜结果可见ATRA诱导组出现大量自噬体和自噬溶酶体,同时细胞间紧密连接增多,并且自噬相关标志蛋白质Beclin1、LC3-II、RAB7水平增高,P62水平无显著变化,LC3-II/LC3-I的比值明显增加(P0.05);激光共聚焦显微镜可见ATRA组细胞质内黄色斑点的自噬体及红色斑点的自噬溶酶体均较对照组明显增多,自噬抑制剂3-MA和Baflomycin可抑制ATRA诱导的HP14-19细胞的ICG摄取和糖原合成功能。综上所述,ATRA可能通过调节细胞自噬水平有效诱导小鼠胚胎肝祖细胞的分化成熟。