与成纤维细胞共培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞的生物学特性

建立胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）与肺成纤维细胞（LF）共培养模型,观察与LF共培养下AECⅡ的生物学特性。倒置相差显微镜观察AECⅡ形态和基本生长情况：RT-PCR和流式细胞术分别检测肺泡表面活性蛋白-C（SP-C）、水通道蛋白5（AQPS）mRNA及蛋白质表达;流式细胞术检测细胞周期及Ki67表达。结果显示,与LF共培养时,AECⅡ能较好地保留其细胞形态。SP-C mRNA及其蛋白质表达明显增加,而AQP5mRNA及其蛋白质表达则明显减少;LF促进AECⅡ增殖,使G2／M、S期细胞及表达Ki67^＋细胞的比率明显增多。结果提示,AECⅡ与LF共培养时,能更好地保留其细胞形态、分化及增殖特性。     

大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的原代分离

目的建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial cells typeⅡ,AECⅡ)分离、纯化、原代培养及鉴定的方法。方法用4.2U/ml的弹性蛋白酶通过气管插管注入肺泡内,消化分离AECⅡ。把细胞悬液接种到包被有大鼠IgG的塑料平皿中纯化细胞。用电镜、碱性磷酸酶显色法、改良巴氏染色法、单宁酸染色法、免疫组化染色法鉴定AECⅡ。结果细胞纯度达到90%以上,倒置显微镜下可见细胞呈岛屿状生长。电镜下可见细胞内有大量板层小体,包膜上有绒毛结构。碱性磷酸酶染色法(BCIP/NBT)可见胞浆内有蓝色颗粒。改良巴氏染色法、单宁酸染色法可见胞浆内有黑色颗粒。抗大鼠肺泡表面活性蛋白A(surfactant protein A,SP-A)免疫组化染色呈阳性反应。结论弹性蛋白酶作用温和,不损伤胞膜,分离所得细胞活力好;IgG免疫粘附纯化法操作简单,纯化效率高。电镜、BCIP/NBT、巴氏染色、单宁酸染色及免疫组化染色等鉴定方法稳定可靠,特异性高。     

黄曲霉素对裸鼹鼠肺泡上皮Ⅱ型细胞基因表达的影响

目的:观察不同浓度黄曲霉素对裸鼹鼠肺泡上皮Ⅱ型细胞(AEC II)相关因子m RNA表达的影响,探讨裸鼹鼠抵御肺癌的分子机制。方法:通过酶消化法分离裸鼹鼠肺组织细胞并用免疫黏附法进行纯化得到裸鼹鼠肺泡上皮Ⅱ型细胞进行原代培养,40小时后,实验组分别给予不同浓度(0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/L)的黄曲霉素处理,溶剂对照组给予DMSO(0.4 m L/L)处理。黄曲霉素作用48小时后收集细胞,用实时定量PCR技术检测裸鼹鼠AECII细胞中的SP-C基因及TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等炎症因子的m RNA表达变化。结果:原代分离的裸鼹鼠AEC II细胞纯度70%,活性90%,可用于体外实验。定量PCR结果显示黄曲霉素使裸鼹鼠AEC II细胞SP-C表达水平显著下降,TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等炎症因子的表达水平在黄曲霉低于2 mg/L浓度的条件下没有显著变化。结论:裸鼹鼠AEC II细胞在黄曲霉素导致细胞受损的情况下,仍然保持较低水平的炎症因子表达,这可能是其抵抗肺癌的机制之一。     

与成纤维细胞共培养的肺泡II型上皮细胞的生物学特性

建立胎鼠肺泡II型上皮细胞(AECII)与肺成纤维细胞(LF)共培养模型,观察与LF共培养下AECII的生物学特性。倒置相差显微镜观察AECII形态和基本生长情况;RT-PCR和流式细胞术分别检测肺泡表面活性蛋白-C(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)mRNA及蛋白质表达;流式细胞术检测细胞周期及Ki67表达。结果显示,与LF共培养时,AECII能较好地保留其细胞形态,SP-CmRNA及其蛋白质表达明显增加,而AQP5mRNA及其蛋白质表达则明显减少;LF促进AECII增殖,使G2/M、S期细胞及表达Ki67 细胞的比率明显增多。结果提示,AECII与LF共培养时,能更好地保留其细胞形态、分化及增殖特性。     

SPC及EGFP共表达载体跟踪人羊水间充质干细胞体外定向分化

目的构建肺泡表面活性蛋白C(SPC)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体pcDNA3.1/SPC/EGFP,探讨其在体外跟踪人羊水间充质干细胞(AF-MSCs)定向分化为II型肺泡上皮细胞(AECII)的作用。方法采用PCR和DNA重组技术构建pcDNA3.1/SPC/EGFP表达载体,脂质体转染至AF-MSCs,G418稳定筛选;将AF-MSCs分为阴性对照组、未转染组和转染组,各组体外诱导培养后荧光显微镜观察SPC启动子调控下游EGFP基因表达活性,RT-PCR检测SPA和SPC mRNA表达水平,Western blot检测SPA和SPC蛋白表达以及电镜观察嗜锇性板层小体。结果成功构建pcDNA3.1/SPC/EGFP表达载体,测序结果与SPC启动子及EGFP序列一致;AF-MSCs体外诱导分化后,在阴性对照组中未见绿色荧光细胞,SPA和SPC mRNA及蛋白均为阴性表达,且未发现嗜锇性板层小体;在未转染组中亦未见绿色荧光细胞,而SPA和SPC mRNA(相对表达量为0.072±0.004和0.087±0.012)及蛋白(相对表达量为0.051±0.008和0.063±0.009)均为阳性表达,并发现嗜锇性板层小体;在转染组中可见绿色荧光细胞,SPA和SPC mRNA(相对表达量为0.109±0.011和0.126±0.017)及蛋白(相对表达量为0.075±0.012和0.081±0.006)均为显著表达,与未转染组相比差异均有统计学意义(t值分别为-5.50、-3.16、-2.90和-2.85,均P0.05),亦可见嗜锇性板层小体。结论经pcDNA3.1/SPC/EGFP表达载体转染的AFMSCs在体外适当诱导下能定向分化为AECII,pcDNA3.1/SPC/EGFP表达载体可能成为跟踪AF-MSCs定向分化的工具,为肺组织再生的干细胞治疗提供研究基础。     

无血清共培养条件下脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用（英文）

目的旨在探究无血清共培养条件下脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cells,BMECs)的增殖作用。方法选取生长状态最佳的UC-MSCs和BMECs,将两种细胞以直接接触和间接接触两种共培养方式作为试验组,直接接触是按照UCMSCs:BMECs分别为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10的浓度梯度混合共培养,间接接触则是提取UC-MSCs的上清液作为条件培养基重悬BMECs,对照组为UC-MSCs和BMECs单纯培养组,并设阴性空白对照,于0、4、8、12、24、36、48、60、72 h时观察各组细胞的生长变化,采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况。结果在48 h,条件培养基BMECs组A值显著高于对照组(P0.05),而1∶2浓度组A值达到峰值,极显著高于对照组(P0.01),显著高于其他各浓度组和条件培养基BMECs组(P0.05)。结论无血清条件下,UC-MSCs和BMECs共培养可以促进BMECs增殖,直接接触促增殖效果优于间接接触,且最适比例为1∶2,最佳时间是48 h。     

ABHD2 基因与慢性阻塞性肺疾病关系的研究进展

ABHD2是在人体内表达的一种水解酶蛋白(/hydrolase protein),尽管底物尚不清楚,但其与慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发生具有密切的相关性。ABHD2基因在肺部主要表达在肺泡II型细胞和肺支气管的非管型平滑肌细胞,参与调节肺泡表面活性物质的合成和分泌。相关研究显示ABHD2基因敲除小鼠可自发形成肺气肿表型。此外,人ABHD2基因的rs12442260多态性可增加COPD的发病风险。因此,ABHD2基因在慢性阻塞性肺疾病的发生发展过程中起着重要的作用。本文主要就ABHD2基因表达与COPD、肺气肿等疾病的相关性进行综述。     

茂丹通脉片含药血清体外诱导 S 分M化C为 内皮细胞的作用

目的：观察芪丹通脉片含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向内皮细胞分化的作用。方法：灌胃法制备芪丹通脉片含药血清和对照血清。采用密度梯度离心法分离和培养大鼠MSCs,取第三代MSCs,采用10wg／LVEGF预诱导24h后,分别加入15％芪丹通脉片含药血清与对照血清体外时MSCs诱导分化,至第7天,利用相差显微镜观察细胞形态改变,透射电镜观察细胞超微结构。免疫荧光方法检测内皮细胞特异性表面标志CD31、Ⅷ因子的表达。结果：至第7天,合15％芪丹通脉片合药血清组诱导后的MSCs形态发生明显改变,呈“卵石样”改变,透射电镜下细胞胞浆内可见Weible-Palade小体,共聚焦显微镜下可见CD31、Ⅷ因子阳性细胞。对照血清组MSCs形态仍呈长梭型,电镜下胞浆内无Weible-Palade小体,共聚焦显微镜下无CD31、Ⅷ因子阳性细胞。结论：益气活血复方芪丹通脉片含药血清具有体外诱导大鼠MSCs向内皮细胞定向分化的作用。     

百草枯诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞TGF-β1的变化及甘草酸二铵干预作用

目的探讨甘草酸二铵(DG)对百草枯(PQ)刺激大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cellⅡ,AECⅡ)分泌TGF-β1的影响及其机制。方法采用不同浓度的PQ溶液(200、400、600、800、1000、1500、2000μmol/L)诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞24h,测定PQ对AECⅡ生存率的影响,了解IC50的PQ浓度。在1000μmol/L PQ诱导下,以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mg/ml浓度DG干预AECⅡ24h,测定DG对PQ诱导AECⅡ生存率的影响,了解DG干预PQ诱导下AECⅡ最高生存率的DG浓度。然后将AECⅡ分为3组,即空白对照组、PQ组(以1000μmol/L PQ培养24h)、DG组(先以0.6mg/ml DG培养2h,再以0.6mg/ml DG+1000μmol/L PQ培养24h),使用倒置显微镜观察AECⅡ的形态改变、生长情况,采用酶联免疫吸附法检测TGF-β1的含量,采用实时荧光定量聚合酶链式反应测定TGF-β1mRNA的表达。结果 IC50的PQ浓度为920.87μmol/L,在1000μmol/L PQ诱导下,以0.6mg/ml浓度DG干预AECⅡ24h的生存率最高。与空白对照组比较,PQ组TGF-β1的含量及其mRNA的表达水平明显升高,差异有统计学意义(P0.05);与PQ组比较,DG组TGF-β1的含量及其mRNA的表达水平明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论本实验成功建立了合适的PQ损伤大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的模型及DG干预模型。甘草酸二铵可以降低百草枯诱导下的AECⅡ分泌TGF-β1水平。     

H2O2致体外培养动脉内皮细胞损伤及山莨菪碱保护

目的:实验以过氧化氢(H2O2)损伤体外培养动脉内皮细胞(AEC),对过氧化氢介导内皮细胞损伤、凋亡的机制进行探讨,观察山莨菪碱(Ani)是否抑制H2O2介导的AEC损伤、凋亡,并探讨Ani保护损伤、凋亡的机制.方法:体外培养AEC随机分组:对照组(正常培养AEC);H2O2损伤组(0.5 mmol/L H2O2损伤12 h);Ani组(不同浓度Ani:0.05,0.1,0.2 mg/mL处理45 min后加0.5 mmol/L H2O2损伤12 h).结果:1.低浓度H2O2(0.5 mmol/L)可以损伤AEC并诱导凋亡.H2O2损伤组台盼蓝着染率及LDH释放率均高于对照组(P<0.01);细胞总抗氧化能力(T-AOC)下降(比对照组P<0.01);琼脂糖凝胶电泳发现凋亡细胞的梯状电泳条带;细胞荧光染色见凋亡形态特征.2.Ani对H2O2诱导的内皮细胞损伤具保护作用.Ani组与H2O2损伤组比较,台盼蓝着染率及LDH释放率下降;T-AOC上升;在Ani 0.2 mg/mL组DNA琼脂糖凝胶电泳未见凋亡细胞特征性的梯状电泳条带;荧光染色未见凋亡细胞特征.结论:1.低浓度过氧化氢使AEC总抗氧化能力明显下降,耗竭细胞抗氧化能力,可致AEC的损伤、凋亡.2.山莨菪碱能减少AEC抗氧化能力的消耗,维持抗氧化能力平衡,保护0.5 mmol/L H2O2 介导的AEC损伤、凋亡.     

1-磷酸鞘氨醇促进间充质干细胞向心肌分化

为研究1-磷酸鞘氨醇 (Sphingosine-1-phosphate,S1P) 对脐带间充质干细胞 (Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs) 和脂肪间充质干细胞 (Adipose derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs) 向心肌分化的影响,探索其适宜的作用时间和浓度,将UC-MSCs和AD-MSCs接种到培养板,用添加不同浓度S1P的心肌细胞培养液诱导两种干细胞向心肌分化,诱导时间分为7 d、14 d和28 d。采用免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白,α-肌动蛋白 (α-actin)、缝隙连接蛋白 (Connexin-43) 以及肌球蛋白重链 (MYH-6) 的表达,并通过共聚焦显微镜和荧光显微镜进行观察;采用MTT分析细胞的活性;膜片钳检测分化细胞的钙瞬变 (此为心肌细胞的功能性指标)。结果表明,S1P与心肌细胞培养液协同作用,能够促进UC-MSCs和AD-MSCs向心肌细胞的分化。并且,随着S1P浓度的增加,促分化作用增强,但细胞活性降低。S1P在心肌细胞培养液中的适宜作用时间为14 d,适宜作用浓度为0.5 μmol/L。而且联合心肌细胞培养液可以使UC-MSCs和AD-MSCs的心肌分化细胞产生钙瞬变,具有类似心肌细胞的功能性。S1P能够与心肌细胞培养液协同作用,促进UC-MSCs和AD-MSCs的心肌功能性分化。     

Tie-2单克隆抗体鉴定人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化的内皮细胞

目的:体外扩增和定向诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向内皮细胞分化,并探讨其可行性和条件.方法:利用Percoll(1 073 g/L)从正常成人骨髓中分离MSCs,用含10?S的LG-DMEM培养基进行纯化和扩增培养,流式细胞仪分析鉴定MSCs的纯度.用含VEGF(10μg/L)的HGDMEM培养基诱导MSCs向内皮细胞定向分化,Tie-2单克隆抗体的免疫组化法和透射电镜(TEM)鉴定其细胞的性质.结果:5.0×105个MSCs在体外扩增15代后,获得了8.0×1012个MSCs,扩增了约1.6×107倍.加入诱导培养体系培养14～21 d,光镜下可观察到内皮细胞呈典型的"鹅卵石"样:90%的细胞Tie-2免疫组化呈阳性反应;TEM下可观察到胞浆内有Weible-palade小体.结论:成人骨髓MSCs在体外具有定向诱导分化为内皮细胞的潜能,为构建心脏组织工程瓣种子细胞的来源提供了可能性.     

热疗通过上调基因PUMA表达诱导胃癌MKN45凋亡

目的探讨热疗诱导胃癌MKN45细胞凋亡及其对胃癌细胞促凋亡蛋白PUMA表达的影响。方法体外复苏与培养人胃癌MKN45细胞。对照组常温(37℃)下培养,实验组按不同时间分组43℃水浴加热胃癌MKN45后培养24h,采用倒置显微镜和透射电镜观察热疗后胃癌细胞的形态结构变化。四甲基偶氮唑盐比色法(MMT)检测细胞增殖抑制。AO/EB荧光双染色法及Annexin-V/PI双染色法流式检测细胞凋亡。Western blot检测促凋亡蛋白PUMA蛋白表达。结果光镜观察发现热疗后MKN45细胞明显皱缩、变圆及细胞漂浮,3h多数细胞漂浮。电镜下可见热疗后MKN45细胞核仁增多,胞核及胞浆出现大小不等的空泡和凋亡小体。MTT实验提示,热疗可明显抑制MKN45细胞生长(P0.01)。AO/EB荧光双染色显示,热疗后细胞呈淡黄或橘红色,胞核呈现致密斑状。热疗0.5h、1h、2h和3h后,AO/EB荧光双染色法及Annexin-V/PI双染色法流式检测细胞凋亡率基本一致。热疗0.5h后细胞凋亡率明显增高,1h略低于0.5h,2h达最高峰。Western blot显示,MKN45细胞各热疗时间的PUMA蛋白表达明显升高,热疗0.5h开始升高,热疗2h达最高峰,1h略低于0.5h,3h有所回落(P0.05)。结论热疗2h诱导胃癌细胞凋亡的效果最佳,并且可通过上调基因PUMA表达诱导胃癌MKN45凋亡。     

云南宣威肺腺癌细胞系SLC—89的建立及其生物学特性

本文报告1例来源于云南宣威县患者的肺癌标本,经体外培养建系成功,命名为SLC-89。该细胞系细胞经HE,瑞氏染色形态符合癌细胞特征。在体外培养已两年多,传代196代,细胞冻存后复苏生长良好。第86代细胞倍增时间为26.4小时,染色体数为非整倍体,众数为超二倍体,长期培养后染色体数明显增加。细胞接种裸鼠有移植瘤生长,组织象与原发肺癌组织象相似。电镜观察细胞表面有微绒毛,浆中可见分泌颗粒,有较多板层小体,表明来源于肺泡上皮。     

不同培养基对干细胞-胰岛复合物培养后形态和功能的影响

探讨3种培养基对干细胞包被胰岛形态和功能的影响。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)、新生猪胰岛细胞(neonatal porcine islet cell clusters,NICCs)混合后分别用NICC培养基(A组)、MSC培养基(B组)、EPC培养基(C组)培养,观察各组中NICCs形态、分泌功能、基因表达水平及混合细胞凋亡率。C组破碎细胞数量明显比A、B两组少,凋亡率低,胰岛素和胰高血糖素基因的mRNA相对表达量高(P0.05)。EPC培养基对NICCs的保护作用最优。     

大鼠BMSCs条件培养基对NSCs形态、生长及分化的影响

通过对SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)及新生鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)进行体外分离、培养及鉴定后,观察BMSCs条件培养基对NSCs向神经细胞分化的影响。采用全贴壁培养法培养BMSCs,并采用流式细胞术鉴定其特异性表面抗原标记。无血清技术培养NSCs,采用免疫荧光技术鉴定其特异性抗原标记。BMSCs条件培养基(含10%胎牛血清的DMEM培养基)对NSCs诱导7 d后,镜下观察细胞形态和生长,并采用免疫荧光技术检测NSCs分化。BMSCs高表达CD90、CD29(90%),而CD45呈阴性表达。免疫荧光染色显示,NSCs标记蛋白Nestin、SOX2为阳性。NSCs经BMSCs培养液诱导分化7 d后经免疫荧光鉴定,MAP-2及GFAP呈阳性,阳性率分别为73.80%和50.47%;NSCs经胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)诱导分化7 d后经免疫荧光鉴定,MAP-2及GFAP呈阳性,阳性率分别为42.14%和31.90%。BMSCs条件培养基可诱导NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,其中BMSCs分泌的细胞因子在诱导分化中可能发挥重要作用。     

小鼠睾丸支持细胞的生物学特性研究

目的:获得高纯度的小鼠支持细胞,用以研究睾丸支持细胞在诱导胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中的作用,同时借助睾丸支持细胞减少进行体内诱导试验时可能产生的免疫排斥反应。方法:用胶原酶和胰蛋白酶组合消化结合选择性贴壁法从1周龄昆明白小鼠睾丸分离获得睾丸支持细胞,纯化后进行体外培养,观察其体外培养的生物学特性。结果:睾丸支持细胞体外培养3～4h即贴壁,贴壁后伸出3～4个突起,为成纤维型细胞,在体外培养2～3d即长满全瓶。油红Ο染色显示,其胞质含有大量脂滴。透射电镜观察结果表明,支持细胞核仁周围有卫星核小体。RT-PCR结果显示获得的细胞表达缪勒管抑制物,不表达促黄体素受体和小鼠VASA同源物。结论:获得了较高纯度的小鼠睾丸支持细胞,可以用于诱导小鼠胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的体内和体外试验。     

黄精多糖对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中PINP和BMP-2表达的影响

探讨黄精多糖(PSP)对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化作用中I型前胶原N端前肽(Procollagen typeⅠN-terminal Propeptide,PINP)和骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)表达的影响。取8周龄雄性BALB/C小鼠1只,无菌操作分离小鼠股骨和胫骨,注射器冲出骨髓制成细胞悬液,传代3次后分为6组用于实验。空白诱导组仅加入等量成骨诱导培养基;阳性对照诱导组加入等量成骨诱导培养基及雌二醇(10-8mol/L);各PSP诱导组:加成骨诱导培养基和各自浓度的PSP(200、300、400、500 mg/mL)。每天在倒置显微镜下观察各组细胞的生长情况及形态变化。倒置相差显微镜镜下观察细胞形态变化。在培养第7 d、第14 d采用ELISA酶联免疫吸附法分别测量细胞PINP和BMP-2的表达量。实验结果显示小鼠骨髓间充质干细胞原代培养呈长梭形,有接触抑制现象,诱导后细胞呈三角形、多角形、不规则形状,细胞生长密集时可重叠生长。各不同浓度PSP诱导组均比非诱导组高表达PINP和BMP-2(P0.01)。表明PSP呈剂量相关性促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,高浓度PSP可显著促进骨髓间充质干细胞骨向分化过程中BMP-2和PINP的表达。