人尿源性干细胞及人脐带间充质干细胞的生物学性状比较

该研究探讨人尿源性干细胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)及人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的生物学性状差异。分离培养hUSCs及hUC-MSCs,显微镜下观察细胞形态,流式细胞术检测干细胞表面标记物,锥虫蓝拒染实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力,划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色、油红O染色及阿利新蓝染色评估多向分化潜能。hUSCs为米粒状贴壁生长细胞,hUC-MSCs为长梭形贴壁细胞,呈旋涡状排列生长,两种细胞表型分析相似,均表达多种间充质干细胞标志物,但CD24在hUC-MSCs表达阳性,而CD105在hUSCs表达阳性。hUC-MSCs的增殖及迁移能力优于hUSCs,但后者的克隆形成能力更强。hUSCs及hUCMSCs都具有成骨、成脂、成软骨分化能力,hUC-MSCs的成骨能力强而hUSCs的成脂能力强。该研究成功分离培养出增殖能力强并具有多向分化潜能的hUSCs,该细胞与hUC-MSCs相比具有相似的生物学性状,可作为再生医学自体移植的理想种子细胞来源。     

糖尿病肾病患者尿源性干细胞的分离鉴定及与健康人尿源性干细胞的细胞生物学比较研究

干细胞移植是糖尿病肾病新的治疗途径,但异种干细胞存在伦理及免疫排斥等问题。该研究从糖尿病肾病患者尿液中提取出一种类似干细胞的细胞,称之为糖尿病病人尿源性干细胞(USCs from patients with diabetic nephropathy,D-USCs),并比较了与健康人尿源性干细胞(urine derived stem cells,USCs)生物学特性的差异。通过观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物,茜素红及油红O染色分别检测成骨和成脂分化潜能,以鉴定其干细胞特性。通过绘制生长曲线比较D-USCs与USCs增殖能力,人促血管生成因子检测试剂盒检测细胞外分泌因子的表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡率的差异。结果表明,此类细胞可以在体外分离培养,连续传代生长,细胞形态保持米粒状,表达间充质干细胞标志物(包括CD 24、CD 29、CD 73、CD 90、CD 105)、周细胞标志物(CD 146),不表达造血干细胞标志物(包括CD 31、CD 34、CD 45),具有成骨和成脂分化的潜能。与USCs相比,D-USCs的增殖能力受到损伤,分泌因子种类基本保持一致,但数量上有所减少,细胞凋亡率升高。综上所述,该研究成功从糖尿病肾病病人尿液中提取出尿源性干细胞,为干细胞移植治疗肾损害提供了可能的新的细胞来源,避免了异体免疫排斥反应。     

儿童腘窝囊肿液中滑膜干细胞的分离及特性鉴定

为了从儿童腘窝囊肿液中分离滑膜间充质干细胞(synovium-derived mesenchymal stem cells,SMSCs),进行体外培养,鉴定其干细胞特性。本实验采用抽取囊肿液、细胞贴壁培养法从腘窝囊肿患儿的囊肿液中分离出滑膜干细胞,进行体外培养、细胞形态学观察、细胞生长曲线绘制及周期的分析,成骨、成脂、成软骨分化能力检测,流式细胞术检测细胞表面标志物,免疫荧光检测干细胞标志物。实验结果显示可采取本方法稳定地从儿童腘窝囊肿液中获取滑膜间充质干细胞,外观梭型状,体外成指数生长,高表达滑膜间充质干细胞表面标记物(CD73,CD90,CD105),表达胚胎间质细胞标记物波形蛋白(vimentin)和成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),经定向诱导培养基培养,可分化为骨,软骨和脂肪细胞,我们可以确定所分离出的细胞即为滑膜间充质干细胞(SMSCs)。本研究证明可从儿童腘窝囊肿液中获取滑膜间充质干细胞,是间充质干细胞有价值的来源。     

尿源性干细胞移植修复慢性肝损伤裸鼠肝脏功能

该研究探讨尿源性干细胞(urine-derived stem cells, USCs)的生物学性状及移植治疗慢性肝损失模型的可能。分离培养USCs,观察细胞形态、流式细胞术检测干细胞表面标记,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色、茜素红染色、油红O染色、ICG(indocyanine green)摄取实验、PAS(periodic acid-Schiff)染色等评估其成骨、成脂和成肝分化。建立四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)诱导的慢性肝损伤模型,尾静脉4次移植USCs,计算肝脏指数,检测血清ALT、AST, HE及Masson染色,评估治疗效果。结果表明, USCs为米粒状贴壁生长细胞,表达多种间充质干细胞标志物:CD24、CD29、CD73、CD90和CD105,表达细胞周期表面标志物CD146,不表达造血细胞表面标志物CD31、CD34、CD45。成骨成肝诱导的USCs后ALP染色、茜素红染色、油红O染色阳性,单纯成肝诱导后几乎无ICG摄取及PAS染色阳性的细胞,而与肝干细胞共培养的USCs诱导组中,约10%细胞有ICG摄取及PAS染色阳性。与模型组相比, USCs移植组肝脏指数显著降低, ALT、AST降低但无统计学意义,肝细胞退行性变及纤维增生明显改善。该研究成功分离培养出增殖能力强并具有多向分化潜能的USCs,移植入慢性肝损伤裸鼠,可在一定程度上修复肝脏损伤。     

胆汁淤积性肝硬化来源的微环境因子对肝脏干细胞分化的影响

该研究探讨了胆汁淤积性肝硬化病理微环境来源的细胞因子在胆总管结扎小鼠不同时间点的表达变化,且在体外致力寻找最优的细胞因子组合高效诱导肝脏干细胞HP14-19分化为成熟肝细胞。以Balb/c小鼠胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)模拟胆汁淤积性肝硬化病理微环境;免疫组织化学检测胆总管结扎小鼠肝组织中细胞因子EGF、HGF及TGF-α的表达;以小鼠胚胎肝干细胞HP14-19细胞为研究对象,以不同浓度在不同时间点进行荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性;qRT-PCR、Western blot检测肝细胞相关标志物表达;吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)及过碘酸–希夫(periodicacid-schiff,PAS)染色检测肝细胞的成熟功能。结果显示,小鼠胆总管结扎能成功模拟胆汁淤积性肝硬化,并随结扎时间延长肝硬化程度加重;与对照相比,在EGF(10 ng/mL)、HGF(20 ng/mL)、TGF-α(20 ng/mL)单独诱导HP14-19细胞能有效增强ALB-Gluc活性(P0.05);且在EGF(10 ng/mL)、HGF(20 ng/mL)、TGF-α(20 ng/mL)联合诱导HP14-19细胞时显著增强ALBGluc活性(P0.05);qRT-PCR、Western-blot显示,ALB、CK18表达随时间增加而增加,而AFP表达则相反。ICG摄取及PAS染色阳性细胞数显著增加(P0.05)。因此,胆汁淤积性肝硬化病理微环境来源的细胞因子能有效促进肝脏干细胞肝向分化,将对细胞因子联合肝脏干细胞移植治疗胆汁淤积性肝硬化有一定的指导意义。     

全反式维甲酸促进骨形态发生蛋白9诱导肝祖细胞成熟分化的作用研究

该文研究了全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)促进骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导肝祖细胞14-19(hepatic progenitor cell 14-19,HP14-19)成熟分化的作用。重组腺病毒Ad-BMP9和ATRA单独及联合作用诱导肝祖细胞HP14-19成熟分化,荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc表达情况,Real-time PCR检测肝脏相关基因DLK、AFP、ALB和TAT的mRNA水平,Western blot及免疫荧光检测AFP、ALB、CK18和UGT1A蛋白质水平,PAS染色和ICG摄取实验检测成熟分化后的功能。Ad-BMP9组和ATRA组的ALB-Gluc活性较对照组增高,而AdBMP9+ATRA组ALB-Gluc活性又显著高于Ad-BMP9组和ATRA组。Ad-BMP9+ATRA组的ALB和TAT mRNA水平以及ALB、CK18和UGT1A蛋白质水平均高于Ad-BMP9组和ATRA组,但肝干细胞标志DLK、AFP的表达均降低(P0.05)。Ad-BMP9+ATRA组的ICG摄取及PAS染色阳性细胞数显著高于Ad-BMP9组和ATRA组。ATRA和Ad-BMP9均诱导肝祖细胞HP14-19成熟分化,联合作用强于单独作用。     

BMP9诱导人脐带间充质干细胞体内外成骨分化的作用研究

目的:探讨人骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)在体内外诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)成骨分化的作用研究。方法:设立Ad-BMP9处理组和Ad-GFP对照组感染hUC-MSCs,两组细胞分别于3天、5天、7天进行ALP活性检测,14天后采用免疫组织化学染色检测骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(Osteopotin,OPN)的表达情况,21天后茜素红染色检测矿化结节的形成;然后收集不同分组hUC-MSC用于裸鼠皮下注射成骨模型的建立,4周后取出离体骨进行Micro-CT扫描和分析,并进行H&E、Masson Trichrome、Alcain Blue染色。结果:BMP9处理组的ALP活性和矿化结节形成明显高于对照组,免疫组化染色结果显示BMP9诱导组的OCN、OPG的阳性表达明显高于对照组;裸鼠皮下注射成骨模型的观察结果显示,空白对照组没有形成肉眼可见的皮下包块,仅感染Ad-BMP9的hUC-MSCs能生成异位骨,且形成的异位骨骨量明显,骨密度平均值为396.05±0.60;H&E染色结果显示BMP9诱导生成的异位骨中形成部分成熟的骨基质和骨小梁,Masson Trichrome染色结果显示BMP9明显诱导hUC-MSCs的基质矿化作用,Alcain Blue染色结果显示BMP9明显诱导hUC-MSCs的软骨内成骨作用。结论:BMP9成功诱导人脐带间充质干细胞的体内外成骨作用,为临床骨组织工程的细胞疗法提供了明确的可行性。     

全反式维甲酸调控自噬促进肝祖细胞成熟分化的作用研究

该研究探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)体外诱导小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞成熟分化及ATRA对细胞自噬水平的调控作用。应用1μmol/L ATRA处理小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞,不同时间点进行荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性,Real-time PCR检测肝细胞相关标志基因的表达,吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)及过碘酸–希夫(periodicacid-schiff,PAS)染色检测细胞的成熟功能;透射电镜观察自噬体及细胞连接,ptf LC3质粒转染细胞,激光共聚焦显微镜观察自噬流,Western blot检测自噬相关标志蛋白质水平等综合分析自噬的变化情况。结果显示,与对照组相比,ATRA可显著增强HP14-19细胞ALB-Gluc活性,抑制肝前体细胞标志DLK和AFP的表达,促进成熟肝细胞标志ALB、CK18、TAT和Apo B的表达,ICG及PAS染色阳性细胞数显著增多(P0.05);透射电镜结果可见ATRA诱导组出现大量自噬体和自噬溶酶体,同时细胞间紧密连接增多,并且自噬相关标志蛋白质Beclin1、LC3-II、RAB7水平增高,P62水平无显著变化,LC3-II/LC3-I的比值明显增加(P0.05);激光共聚焦显微镜可见ATRA组细胞质内黄色斑点的自噬体及红色斑点的自噬溶酶体均较对照组明显增多,自噬抑制剂3-MA和Baflomycin可抑制ATRA诱导的HP14-19细胞的ICG摄取和糖原合成功能。综上所述,ATRA可能通过调节细胞自噬水平有效诱导小鼠胚胎肝祖细胞的分化成熟。