双依他尼酸乙醇胺对谷胱甘肽S-转硫酶mu的选择性抑制作用

谷胱甘肽S-转移酶(GST)的同工酶mu(GSTM)高表达与卵巢癌顺铂耐药有关.以GST非选择性抑制剂依他尼酸设计二价潜抑制剂双依他尼酸乙醇胺(aminoethanol di-ethacrynic acid,ADEA),测定ADEA及其与还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)加合物对GST同工酶亚型A1、P1、M2的半抑制浓度(IC50)、抑制类型、结合比和结合动力学.ADEA本身对GSTM2的IC50比GSTA1低300倍,比GSTP1低3 000倍;ADEA与GSH在酶催化下反应10 min所得产物,对上述3种同工酶的IC50 分别降低5、57、200倍.ADEA本身和产物对GSTM2相对于底物CDNB是反竞争性抑制剂,ADEA本身对GSTM2相对于底物GSH是混合性抑制剂,ADEA与GSH产物对GSTM2相对于底物GSH是反竞争性抑制剂.分析ADEA对GSTM2荧光静态淬灭表明ADEA及其产物是二价结合;分析荧光和酶活性随时间变化表明酶与ADEA本身结合速度比其产物CDNB慢10倍.ADEA是有效的GSTM2选择性二价潜抑制剂.     

常见呼吸道病毒多重PCR检测法的质量控制分析

急性呼吸道感染广泛分布于人群中,主要由呼吸道病毒引起,在老年人和婴幼儿中具有较高的发病率和死亡率。快速准确检测出病原体对临床早期诊断和指导治疗有重要意义。本文通过分析16种常见呼吸道病毒多重PCR检测法的质量控制关键环节和质量控制措施,对有效加强实验室质量管理,从而为提高实验室核酸检测质量水平提供了基本的参考数据。     

凝聚法制备川芎嗪固体脂质纳米粒

目的:制备川芎嗪固体脂质纳米粒.方法:采用凝聚法制备,并以包封率和载药量为指标采用正交设计法优化川芎嗪固体脂质纳米粒的制备工艺,并利用透射电镜、激光粒度分析仪、Zeta电位测定仪表征了其药剂学性质结果:所得川芎嗪固体脂质纳米粒的最佳制备处方是川芎嗪45mg,卵磷脂600mg,硬脂酸450mg,0.4%的泊洛沙姆60ml 结论:该处方可用于川芎嗪固体脂质纳米粒的制备,工艺简单、可行.     

建立新型的常见腹泻相关病毒的多重检测方法

利用GenomeLab(tm)GeXP遗传分析系统建立一种同时检测A组轮状病毒、诺如病毒GI、GII型、札如病毒、肠道腺病毒、星状病毒、人博卡病毒II型7种常见腹泻相关病毒的方法。对反应条件进行优化后,非同日三次重复实验表明至少在104拷贝/μL水平可同时特异地检测出7种病毒,对Enterovirus71、Human Parechovirus、Picobir-navirusII阳性标本无交叉反应。本研究初步建立了一种高通量、快速的常见腹泻相关病毒的检测方法,为腹泻病原的分子诊断提供了新的方法。     

基于颜色判定的环介导等温扩增技术检测HPV6和HPV16

建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,即环介导等温核酸扩增技术(LAMP)应用于HPV6和HPV16亚型的检测。该技术设计分别对应于HPV6和16的E6和E7基因序列中6个区段的4条特异引物,在等温条件下(63℃)进行核酸扩增反应1h,在扩增前加入HNB染料(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB染料颜色的变化做为结果判定的标准,并经LA-320实时浊度仪和琼脂糖电泳证实。文中利用这种技术对13份已知的单重感染13种HPV不同亚型的临床样本进行了特异性分析,同时对2个含目的片段的克隆质粒的系列稀释物进行了灵敏度分析。结果显示LAMP方法特异性高,颜色法判断的灵敏度均为1000个拷贝DNA分子水平,比Real-time PCR低10～20倍,对62份宫颈刮片临床标本的HPV6和HPV16检出率和HPV分型试剂盒一致。因此,基于颜色判定的环介导等温扩增方法有望应用于人乳头瘤病毒HPV6和HPV16感染的快速筛选,具有在基层疾病预防控制中心和医院推广和应用的潜力。     

生物蛋白胶封堵合并宫颈环扎术治疗胎膜早破的疗效观察

目的:观察生物蛋白胶封堵合并宫颈环扎术治疗胎膜早破,对孕妇、胎儿及新生儿的影响,明确该技术治疗胎膜早破的疗效。方法:我院产科共收治妊娠<30周胎膜早破患者48例,采用生物蛋白胶封堵合并宫颈环扎术治疗胎膜早破,观察治疗后孕妇羊水指数,胎儿双顶径,新生儿出生时体重,及孕妇的副反应。结果:在本次封堵治疗过程中均一次封堵成功,没有不良反应发生,所有孕妇术后阴道流水情况均明显改善,其中有2例孕妇术后1周阴道流水停止。所有孕妇术后羊水漏出量均明显减少,B超检查显示羊水指数均在(6±2)cm,胎儿每周双顶径增长均达到(0.15±0.02)cm,延长孕周最短(5±2)w,10例早产,38例继续妊娠至37 w。新生儿出生时体重为(2000±260)g,无1例发生NRDS。同期没有进行宫颈内封堵仅行药物保胎治疗的10例孕妇,胎龄延长最长达到10 d,最短者24 h内出现早产分娩,早产儿平均体重1400 g,均发生NRDS,有2例放弃治疗,4例在NICU行治疗,最终因各种并发症死亡。48例行封堵治疗孕妇未发生过敏反应,无阴道出血及产后出血和感染等。结论:应用生物蛋白胶结合宫颈环扎术治疗胎膜早破,手术操作简单,可延长了孕周,提高了新生儿成活率,无不良反应,具有广泛的应用前景。     

季也蒙毕赤酵母菌尿酸酶基因的克隆、重组表达及表征

目的:克隆一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶蛋白编码基因,并通过重组表达和表征进行确认。方法:测定酵母细胞株C.G.M.C.C 2.1008的rRNA序列鉴定其所属种,串联质谱分析此天然尿酸酶肽段序列搜索同源蛋白,测定转录组验证其诱导表达属性,据季也蒙毕赤酵母ATCC6260基因组信息推断所得尿酸酶(Uniprot id:A5DFP1)的编码序列设计引物,从C.G.M.C.C 2.1008细胞株cDNA中PCR扩增尿酸酶基因,测序后再克隆至定向表达载体pDE1及pDE2中构建带6His标签的重组表达质粒pDE1-MGU和pDE2-MGU,同时构建无6His标签的表达质粒RMGU。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达此真菌尿酸酶,SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS测定肽段分子质量,以尿酸为底物测定其动力学参数及抑制剂敏感性等性质,并与天然尿酸酶进行比较。结果:rRNA序列表明此菌株为季也蒙毕赤酵母,串联质谱分析胰蛋白酶解肽段表明此天然真菌尿酸酶与尿酸酶A5DFP1高度相似,转录组测序支持此尿酸酶基因高效诱导表达。用所设计引物经PCR从cDNA快速获得编码序列,T载体测序显示其与A5DFP1编码序列仅在第435位碱基不同但氨基酸仍相同。SDS-PAGE发现重组R-MGU肽段约35k Da;MALDI-TOF-MS发现其肽段约17.43k Da且与天然酶一致,但按氨基酸序列计算分子质量仅为33.98k Da,表明其可能存在化学修饰。重组表达带6His标签尿酸酶纯化后比活性接近6.0U/mg;R-MGU米氏常数、代表抑制剂的抑制常数及分子质量与天然尿酸酶无差别,但R-MGU很难纯化,使其相同条件下的热稳定性比纯化天然酶略差。结论:成功克隆了一种季也蒙毕赤酵母菌的尿酸酶,并实现其活性形式的重组表达。     

磁珠固定化结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶及其表征

比较Ni~(2+)-NTA磁珠和羧基磁珠固定结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mycobacteriumtuberculosis dihydrofolate reductase,Mt DHFR),探索适合小分子配体混合物库筛选的Mt DHFR固定化方法。重组表达带6×His标签Mt DHFR,纯化后表征酶学性质,比较用Ni~(2+)-NTA磁珠和羧基磁珠固定化时相应固定化容量、保留活性、稳定性及对抑制剂响应。结果表明,Ni~(2+)-NTA磁珠对Mt DHFR固定化容量为(93±12)mg/g磁珠(n=3),但酶比活保留不超过32%,Ni~(2+)明显抑制酶活性,EDTA与Ni~(2+)呈协同抑制效应,Fe~(3+)无显著干扰。羧基磁珠活化固定Mt DHFR的容量(8.6±0.6) mg/g磁珠(n=3),固定化酶比活保留(87±4)%(n=3)。在含50 mmol/L KCl的100 mmol/L HEPES (pH 7.0)中,游离和固定化Mt DHFR在0℃保存16 h活性都无显著改变,但在25℃保存16 h,游离酶活性下降近60%而羧基磁珠固定化Mt DHFR活性下降仅35%。甲氨喋呤对游离Mt DHFR和固定化Mt DHFR的IC50无显著差异(P0.05)。综上,Ni~(2+)-NTA磁珠不适合固定化Mt DHFR;羧基磁珠固定化Mt DHFR能保留活性、热稳定性及对抑制剂的响应,该固定化方法有望用于快速筛选其配体混合物库。     

一种基于新型再测序芯片的不明原因呼吸道感染样品检测方法的建立

再测序芯片(Resequencing Pathogen Microarray,RPM)是一种新的基于微阵列DNA芯片的病原体检测与鉴定技术。为了将RPM应用于不明原因呼吸道感染的检测,提高应对传染病暴发的能力,本研究建立了基于一种新型RPM的呼吸道多病原检测方法。该方法可以同时检测19种常见呼吸道病毒、9种甲型流感(Flu A)和11种鼻病毒(HRV)、28种肠病毒、18种少见呼吸道病毒。选取已验证的16种常见呼吸道病毒感染阳性的样本评价RPM的特异性,用克隆质粒或体外转录的RNA梯度稀释液来检验RPM的灵敏度,在10～103拷贝/反应水平时RPM仍能检测和分辨出相近的病毒亚型。将8份不明原因的咽拭子样品提取的核酸合并,用新建立的方法进行检测,根据RPM结果再以普通PCR加测序作为验证,同时和Abbott公司的质谱测序(PLEX-ID)结果进行比较,除RPM检出假阳性PIV1外,三者的其余检测结果一致。结果表明,这种基于新型RPM的方法具有高灵敏度、高通量的优点,对应对新发和突发传染病具有重要意义。