磁珠固定化结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶及其表征

比较Ni~(2+)-NTA磁珠和羧基磁珠固定结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mycobacteriumtuberculosis dihydrofolate reductase,Mt DHFR),探索适合小分子配体混合物库筛选的Mt DHFR固定化方法。重组表达带6×His标签Mt DHFR,纯化后表征酶学性质,比较用Ni~(2+)-NTA磁珠和羧基磁珠固定化时相应固定化容量、保留活性、稳定性及对抑制剂响应。结果表明,Ni~(2+)-NTA磁珠对Mt DHFR固定化容量为(93±12)mg/g磁珠(n=3),但酶比活保留不超过32%,Ni~(2+)明显抑制酶活性,EDTA与Ni~(2+)呈协同抑制效应,Fe~(3+)无显著干扰。羧基磁珠活化固定Mt DHFR的容量(8.6±0.6) mg/g磁珠(n=3),固定化酶比活保留(87±4)%(n=3)。在含50 mmol/L KCl的100 mmol/L HEPES (pH 7.0)中,游离和固定化Mt DHFR在0℃保存16 h活性都无显著改变,但在25℃保存16 h,游离酶活性下降近60%而羧基磁珠固定化Mt DHFR活性下降仅35%。甲氨喋呤对游离Mt DHFR和固定化Mt DHFR的IC50无显著差异(P0.05)。综上,Ni~(2+)-NTA磁珠不适合固定化Mt DHFR;羧基磁珠固定化Mt DHFR能保留活性、热稳定性及对抑制剂的响应,该固定化方法有望用于快速筛选其配体混合物库。