江南卷柏Phi类谷胱甘肽S-转移酶的分子特性

谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)在帮助植物抵抗各种胁迫中发挥重要作用。该研究从江南卷柏Selaginella moellendorffii中克隆到两个Phi类GST基因,分别命名为Sm GSTF1和Sm GSTF2,两个基因均编码215个氨基酸残基的蛋白质。表达模式分析发现,这两个基因在江南卷柏根、茎和叶中均有表达。将这两个基因在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白并纯化,酶学性质分析表明Sm GSTF1和Sm GSTF2对CDNB、NBD-Cl和NBC等3种底物都有活性。Sm GSTF1对Fluorodifen和Cum-OOH也有活性,而Sm GSTF2对它们没有活性。酶动力学分析表明Sm GSTF1和Sm GSTF2对GSH有较高的亲和力,而对CDNB的亲和力都相对较低。在不同p H及温度条件下对Sm GSTF1和Sm GSTF2重组蛋白进行活性测定,发现这两个蛋白在p H 7-8.5,45-55℃温度范围内有较高的催化活性。研究推测,Sm GSTF1和Sm GSTF2可能在江南卷柏的抗逆生理过程中有重要的作用。     

外源一氧化氮供体对NaCl胁迫下多裂骆驼蓬幼苗叶片ASA-GSH循环的影响

研究了外源一氧化氮(NO)供体硝普钠(SNP)对NaCl胁迫下多裂骆驼蓬幼苗抗坏血酸(ASA)-谷胱甘肽(GSH)循环抗氧化系统及H2O2和丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,0.15mmol.L-1SNP能提高300mmol.L-1NaCl胁迫下多裂骆驼蓬幼苗叶片抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽转硫酶(GST)活性,增加还原型抗坏血酸(ASA)和谷胱甘肽(GSH)含量,降低脱氢抗坏血酸(DHA)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量,提高ASA/DHA、GSH/GSSG比率,降低H2O2和MDA水平,对单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性无显著影响。NO信号转导途径关键酶鸟苷酸环化酶(GC)抑制剂亚甲基蓝(MB)逆转了SNP对盐胁迫下APX、GR、GST活性和ASA、GSH、DHA,H2O2、MDA含量及ASA/DHA、GSH/GSSG比率的调节效应。由此表明,NO可能通过GC介导的cGMP信号转导参与ASA-GSH循环活性氧清除系统的调节,从而缓解盐胁迫诱导的氧化伤害。     

盐酸埃克替尼与多西他赛、培美曲塞不同联合方式对非小细胞肺癌PC-9细胞系作用的实验研究

目的:探讨盐酸埃克替尼以不同次序联合多西他赛、培美曲塞对非小细胞肺癌细胞系PC-9的作用。方法:运用xCELLigence系统检验多西他赛、培美曲塞、盐酸埃克替尼单药作用于PC-9细胞系的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50),用流式细胞仪检测埃克替尼与多西他赛/培美曲塞联合的不同组合方式对PC-9细胞系的细胞周期影响及凋亡。结果:1埃克替尼对PC-9细胞作用60 h后的IC50值为5.3μM;多西他赛对PC-9细胞作用36 h后的IC50为21.5 mg·m L-1;培美曲塞对PC-9细胞作用36 h后的IC50为30μM。2Annexin V-FITC凋亡实验观察到化疗药先于埃克替尼应用对靶细胞的体外杀伤作用均明显高于其他各组,先用多西他赛组细胞凋亡率为(23±0.2)%,高于先用埃克替尼组(10.2±0.1)%和两药同时用药组(15.8±0.4)%;先用培美曲塞组细胞凋亡率为(36.3±0.03)%,高于先用埃克替尼组(14.7±0.1)%和两药同时用药组(30.6±0.03)%,差异有统计学意义(P0.05)。3流式细胞仪周期检测结果显示埃克替尼先于多西他赛(或培美曲塞)用药或两药同时应用时PC-9细胞G0/G1期比例比多西他赛(或培美曲塞)先于埃克替尼用药组高。结论:多西他赛、培美曲塞先于埃克替尼应用方案对肿瘤细胞杀伤作用优于晚用埃克替尼或同时应用埃克替尼。     

产黄青霉谷胱甘肽S-转移酶基因PcgstA的克隆与鉴定

从青霉素工业生产菌产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)中首次克隆了一个谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因,定名为PcgstA.该基因的开放阅读框长840bp,含有两个内含子,编码一个238氨基酸残基的蛋白质.其推断的氨基酸序列与一些已经鉴定的丝状真菌GST具有50%左右的序列一致性.PcgstA的完整编码区经RT-PCR扩增、验证,插入原核表达载体pET11a,转化大肠杆菌BL21(DE3)-RP菌株,表达得到重组PcGSTA蛋白.酶活测定证实,重组PcGSTA具有GST活性,其对底物CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene)的比活为(0.159±0.031)μmol/(min·mg).利用TaqMan探针法,对PcgstA的表达情况进行了比较.结果表明,在添加了侧链前体苯乙酸的青霉素生产培养基中,PcgstA的表达水平和在不含苯乙酸培养基中的表达相比明显下调,显示了该基因与苯乙酸代谢的关系.     

毛白杨两个Phi类GST基因的克隆及生化特性

谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)在植物的抗逆反应、细胞信号转导和抗病等方面发挥着重要作用.从毛白杨(Populus tomentosa)中克隆到2个Phi类GS7因(PtoGSTF1和PtoGSTF2),它们分别编码215和218个氨基酸残基的蛋白质.DNA序列分析显示这2个基因均含有2个内含子.组织表达模式分析表明,这2个基因在毛白杨的根、茎、叶、韧皮部和顶芽组织中均表达,是组成型表达基因.在大肠杆菌中表达这2个基因并纯化重组蛋白.酶活性分析显示PtoGSTF1和PtoGSTF2蛋白对底物CDNB、NBD-CI、NBC和Cum-OOH都具有酶学活性,但活性差异较大.动力学分析显示,PtoGSTF2对NBD-CI的亲和力是PtoGSTF1的2.5倍,但PtoGSTF1的催化效率是PtoGSTF2的56.8倍.热力学稳定性分析显示,PtoGSTF1比PtoGSTF2具有更高的热力学稳定性.因此,酶学性质的差异预示着这2个Phi类GS7基因可能存在功能上的分化.     

谷胱甘肽S-转移酶活性中心的研究—羧基、氨基和胍基的化学修饰

用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC),2.4.6.三硝基苯磺酸(TNBS)和丁二酮(DIC)分别修饰人胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)的羧基、氨基和胍基,研究了酶的失活动力学,发现引起一分子酶亚基全部失活所需抑制剂的分子数分别为1.0、1.08和0.98,提示每亚基只有一个羧基、氨基和胍基参与酶的活性中心。底物及其类似物谷胱甘肽,S-己烷或S-辛烷谷胱甘肽可保护GST-π免受上述抑制剂的修饰,使假一级反应速度常数k_1明显降低,说明羧基、氨基和胍基是GST-π和GSH结合部位的组成基团。作者曾证明GST-π中的一个快反应巯基也参与酶与GSH的结合,故至少有四个不同的基团是酶亚基的结合基团,本文还对TNBS对氨基修饰的特异性作了验证,并讨论了GST-π与GSH结合时形成离子键的情况。     

人细胞核dUTPase的克隆表达及其酶学活性

以阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者脑cDNA文库质粒为模板 ,用PCR方法扩增得到人细胞核dUTP焦磷酸酶 (dUTPase)的cDNA ,将其克隆到谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 4T 1中 ,并在大肠杆菌BL2 1中获得高效表达 .表达的融合蛋白GST dUTPase经过谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,凝血酶酶切和SephacrylS 10 0纯化 ,得到高纯度dUTPase蛋白 .通过SDS PAGE ,氨基酸组成分析 ,N端氨基酸序列测定以及HPLC测Mr 结果与期望值一致 .通过检测该酶水解dUTP释放的焦磷酸 (PPi)来测定表达产物dUTPase蛋白及GST dUTPase融合蛋白的酶活性 ,发现两蛋白都具有正常的酶水解dUTP活性 ,但融合蛋白的活性比dUTPase蛋白低 7～ 8倍 .同时研究了Mg2 +和EDTA对酶活性的影响     

CO2激光处理对干旱胁迫小麦幼苗谷胱甘肽抗氧化酶系统的影响

用CO2激光(波长10600 nm,辐射剂量20.1 mW/mm2)对萌动小麦种子分别辐照0、 1、 3、 5 min, 待其长至12 d时,用10%(W/V)PEG 6000胁迫其幼苗.结果表明:CO2激光处理1、 3、 5 min显著提高了还原型谷胱甘肽(GSH)含量,显著降低了氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量(5 min除外),导致GSH/GSSG比率显著上升.3 min激光处理显著提高了干旱胁迫下小麦幼苗叶片谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性.通过参与降解因干旱胁迫而过量产生的过氧化产物,实现了细胞解毒功能.此外,1 min和3 min激光处理可显著提高干旱胁迫下小麦幼苗抗坏血酸氧化酶(APX)活性和抗坏血酸(AsA)含量,提高了组织内部的抗氧化能力,从而起到保护作用.     

人胎盘谷胱甘肽S-转移酶的纯化和性质

将人胎盘组织粗匀浆经105000×g超速离心后,用S-已基谷胱甘肽-琼脂糖-6B亲和层析一步纯化法获得电泳纯的人胎盘GST(简称GST-π)。其比活性较粗匀浆高194.7倍,回收率为50％。再经DE_(52)交换柱进一步纯化,用KCl浓度梯度洗脱后为单一锐峰,等电聚集电泳呈一条带,等电点(pI)为4.60。GST-π经TSKgel-G3000SW柱高效液相层析,也为单一对称锐峰,测得其分子量为45.2kD;在SDS-PAGE电泳也为单一区带,测得其亚基单位的分子量为22.5kD。GST-π氨基酸组成分析可检出十六种氨基酸,其中以谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天冬氨酸及甘氨酸含量较高。 GST-π酶动力学研究证明GST-π以GST和CDNB为底物时km值分别为0.16mmol/L和0.55mmol/L,经测定表明,GST-π的最适作用pH值为7.5,在pH6.5—9的范围内较为稳定,体外GST-π在温度超过25℃对容易失活。以GST-π为抗原,得到兔抗人GST-π抗血清,其效价为1:32,与人肝GSTs不发生免疫交叉反应。     

长吻鮠碱性磷酸酶的动力学研究

采用生化手段,从长吻鮠(Leiocassis longirostris Günther)肝中提取出碱性磷酸酶(AKP).提纯倍数为62.08倍,比活为66.43单位/mg蛋白,提取酶液经PAGE和SDS-PAGE只呈现一条区带.该酶的最适pH为10.05,7.0>pH>11.0时不稳定;最适温度为40℃,;对热不很稳定;以磷酸苯二钠为底物其Km值为1.82×10-3mol/L.Mg2+为该酶的激活剂,L-Cys、KH2PO4、DFP、ME、EDTA-Na2为抑制剂.选用KH2PO4,和DFP作抑制类型的判断,结果表明,KH2PO4,属竞争性抑制剂,其抑制常数为2.41mmol/L,DFP为非竞争性抑制剂,抑制常数为1.01mmol/L.       

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.