副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及应用

目的摸索出一套副溶血性弧菌基因敲除的可靠方案,副溶血性弧菌致病相关基因的敲除对深入研究其致病机制有重要意义。方法通过融合PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pDS132上,将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中,再接合转移到副溶血性弧菌菌株内,经pDS132质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株。结果成功构建了副溶血性弧菌RIMD2210633菌株ΔopaR,ΔtoxR和ΔaphA三个基因突变株。结论通过自杀载体同源重组成功获得精确敲除的无痕突变株更有利于基因功能的研究,使后续副溶血性弧菌突变株与野生株的对比研究成为可能。     

人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠Fas／Fas—L、Caspase-3表达的影响

通过人参皂甙Rg1对局灶性脑缺血再灌注大鼠膜蛋白（Fas）、膜蛋白配体（Fas—L）、胱天蛋白酶（Caspase-3）表达的影响,探讨人参皂甙Rg1的作用机制。本实验将SD大鼠随机分为假手术组、单纯缺血再灌注组、人参皂甙R1 10、20、40mg．kg^-1组、尼莫地平1mg．kg^-1组,采用大脑中动脉闭塞法建立脑缺血再灌注模型,24h后观察海马CA1区,     

人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

目的探讨人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织Bcl-2和Bax表达的影响及其意义。方法分别给大鼠腹腔注射人参皂甙Rg1 10、20、40 mg/kg,采用大脑中动脉闭塞方法建立脑缺血再灌注模型,观察大鼠脑缺血再灌注后不同时间段（2 h、24 h）神经功能缺损评分;应用免疫组化法检测脑组织缺血再灌注24h后Bcl-2、Bax的表达。结果人参皂甙Rg1组大鼠脑缺血后各时间点神经功能缺损评分显著低于单纯缺血再灌注组（P〈0.05）;与单纯缺血再灌注组相比,人参皂甙Rg1各组Bcl-2表达显著增高,Bax表达显著降低,Bcl-2/Bax比值显著上调（P〈0.05）。结论人参皂甙Rg1防治大鼠脑缺血再灌注损伤的机制可能与促进脑组织Bcl-2表达、抑制Bax表达有关,且以高剂量效果较好。     

西双版纳入侵长足捷蚁与土著黄猄蚁的种间竞争

【目的】入侵物种能够通过竞争影响本地物种的种群,从而影响入侵地的生物多样性。长足光捷蚁Anoplolepis gracilipes是全球最具破坏力的入侵蚂蚁之一。本研究旨在明确西双版纳地区入侵长足捷蚁与土著优势种蚂蚁黄猄蚁Oecophylla smaragdina之间的竞争关系。【方法】通过野外调查和室内控制试验相结合的方法,观察和对比分析长足捷蚁和黄猄蚁的体型大小,雾凉季和雨季的巢穴外觅食活动规律,觅食能力(搜寻食物的时间、在觅食时间内召集的最大工蚁数),打斗行为(不同打斗组合的攻击强度和死亡率)以及对饥渴的耐受性(无食物和水分供应时平均存活时间和存活率随时间的变化)。【结果】长足捷蚁工蚁体长(3.66±0.06 mm)显著小于黄猄蚁工蚁(8.27±0.16 mm)。在雾凉季时,长足捷蚁具有比黄猄蚁更长的觅食活动时间;而在雨季时,两种蚂蚁均在下午温度较高时段觅食活动的个体数量减少。苹果、蜂蜜和火腿肠3种食物作为诱饵时,长足捷蚁具有更快搜寻食物的能力,4~8 min便能找寻到食物,而黄猄蚁需要8~21 min才能找寻到食物,此外在寻找到食物后,长足捷蚁也有更快召集同伴的能力。在人工控制试验中,1头长足捷蚁和1头黄猄蚁同时存在时主要以不攻击和低强度攻击为主,而当两种蚂蚁中的任意其中一种的个体数量增加到5头时,攻击强度会显著增加,两种蚂蚁均存在种间协作行为。在饥渴状态下,两种蚂蚁工蚁的平均存活时间差异不显著,但长足捷蚁最长存活120 h,黄猄蚁最长存活96 h。【结论】在西双版纳地区,长足捷蚁相较于土著黄猄蚁具有更强的觅食的能力,雾凉季觅食活动时间更长,暗示长足捷蚁可能具有较强的温度适应能力。有必要加强对这一入侵蚂蚁的研究,并密切关注其种群在该地区的发展。     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP1编码基因沉默对NF—kB表达的影响

目的：探讨EBV阳性胃上皮细胞中潜伏膜蛋白1（latentmembraneprotein-1,LMP1）基因沉默对NF-kB转录表达的影响。方法：以稳定表达LMP1的EBV阳性胃上皮细胞系作为靶细胞,采用化学合成的siRNA特异性沉默LMP1,用RT-PCR和Westem-blotting分别检测其在不同时间段mRNA和蛋白水平特异性沉默效果;Westernblotting及免疫酶染色法检测LMP1基因沉默对NF—kB转录表达及核转移的影响。结果：siRNA在mRNA和蛋白水平可特异性沉默LMP1的表达,且有时间效应关系;Westem blotting及免疫酶染色法检测结果显示LMP1沉默可干扰NF—KB表达,导致靶细胞核内NF-kB水平下降,细胞浆内水平升高,而NF—kB总蛋白有下降趋势。结论：LMP1基因特异性沉默能够影响NF-kB表达,抑制其核转移。     

结核分枝杆菌生物膜形成相关基因的筛选与鉴定

目的:通过菌落表型变化并结合生物膜生长缺陷筛选并鉴定可能与生物膜形成相关基因.方法:利用带有Himarl转座子的MycoMarT7转座子系统建立结核分枝杆菌H37Ra随机插入突变库;筛选细菌表面结构发生变化和生物膜形成有变化的突变菌株;运用T-A克隆法并结合抗性标记挽救法获得突变菌株的随机插入基因侧翼序列从而鉴定突变基因,并运用生物信息学方法分析预测突变基因的功能.结果:通过菌落形态变化及生物膜缺陷表型筛选出39株突变株,成功鉴定其中16株突变株,涉及16个基因发生突变,其中5个与脂质代谢相关,4个与细胞壁合成相关、2个与中间代谢和呼吸作用相关、1个调节蛋白相关基因,1个毒力相关基因,1个PE/PPE家族基因,还有2个功能未知基因.结合生物膜形成缺陷分析,其中8个基因可能与H37Ra体外生物膜的形成相关.结论:成功构建库容量约为l×104结核分枝杆菌转座子随机插入突变文库,筛选获得生物膜生长受损突变株及可能与结核分枝杆菌生物膜形成相关的基因信息,为后续深入开展生物膜形成机制研究奠定基础.     

花苜蓿小尺度空间遗传结构研究

以花苜蓿（Medicago ruthenica Trautv.）为材料,在内蒙古克什克腾旗建立两个25 m×50 m的样方（山谷YF1和山坡YF2）,采集该范围内的所有个体,利用8对SSR分子标记对其遗传变异特性进行分析。结果显示,克什克腾旗花苜蓿居群遗传多样性较高。两个居群个体的空间自相关分析结果表明,9 m内的个体间为非随机邻近交配,且在同距离范围内,山谷居群的个体间遗传相似性更低,推测此区域可能是历史和地理因素塑造了花苜蓿丰富的遗传多样性,两个小尺度空间格局的个体间基因流模式主要受地形影响。     

人金属硫蛋白在乳酸菌中的融合表达及其预防食源性镉污染的应用

目的:镉(Cd)是一种重要的环境污染物,其具有半衰期长、不能生物降解等特性使之易于在人体重要脏器中蓄积并对人身体健康造成不可逆的损伤。为此,减少镉的摄入,尤其是经胃肠道,是预防人体慢性镉中毒的有效方法。方法:构建以α-半乳糖苷酶作为筛选标记、表达金属硫蛋白融合蛋白(GST-SUMO-MT)的重组乳酸乳球菌MG1363/p M-GSMT。原子吸收光谱法分析重组乳酸菌对Cd~(2+)和Zn~+的结合能力。以灌胃方式,对雄性Sprague-Dawley大鼠每天口服不同剂量的重组乳酸菌(2×10~9~2×10~(11)CFU/d)及CdCl_2溶液[5mg/(kg·d)],连续处理56天。收集实验动物肝、肾、脑及睾丸,利用原子吸收光谱法检测这些脏器中镉离子的含量。生化分析检测血清中尿素及丙氨酸转氨酶的含量。石蜡切片及苏木精-伊红染色分析各组织的病理变化。结果:获得不含抗生素抗性的重组乳酸菌MG1363/p M-GSMT,其吸附Cd~(2+)、Zn~(2+)能力比对照组分别提高3.52倍和1.60倍。动物实验结果显示,镉能在肝、肾、脑及睾丸中蓄积,并对这些器官造成明显的病理损伤。原子吸收光谱分析、血清生化指标及病理切片结果都显示,重组乳酸菌能有效降低胃肠道中镉的摄入,进而减少Cd~(2+)在各脏器中的蓄积及对器官功能的损伤。结论:为预防人体食源性慢性镉中毒提供了一种有效的生物材料和使用方法。     

堤岸田鼠(Bank Vole)重组朊蛋白在RT-QuIC反应上的特点及其关键位点的作用探索

堤岸田鼠对很多种属的朊病毒易感。在堤岸田鼠的朊蛋白氨基酸序列中,只有两个位点是同仓鼠和小鼠都不相同的,分别是位于C端的227位和230位。为了评估这两个位点对堤岸田鼠RT-QuIC反应的影响,我们构建了田鼠野生型(Vole-WT),两种突变型(Vole-E227D,Vole-S230R),以及仓鼠野生型(Ha-WT)蛋白用于RT-QuIC反应。结果显示田鼠野生型及两种突变型具有极强的RT-QuIC反应效率。即使在较弱的反应条件下,田鼠野生型及突变型也表现出比仓鼠更高的反应效率。其中Vole-E227D在三种田鼠蛋白中是效率最高的,随后为野生型和Vole-S230R。我们的结果表明堤岸田鼠朊蛋白氨基酸227位和230位不是造成堤岸田鼠RT-QuIC反应如此高的原因,但特定氨基酸位点的改变会在一定程度上影响朊蛋白的RT-QuIC反应效率。     

DLL4蛋白真核表达及多克隆抗体制备

该研究旨为克隆、表达和纯化出人源DLL4蛋白,并制备出相对应的多克隆抗体。采用搭桥PCR,构建带有t PA信号肽的DLL4基因,并克隆到p GZX表达载体上,经过酶切和测序鉴定后,瞬时转染到HEK293F细胞中,转染48 h后对发酵上清液进行镍柱亲和纯化。利用Dot blotting、Western blotting和Fortebio大分子互作仪检测DLL4的生物活性;免疫兔子制备DLL4多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测抗体特异性。PCR扩增出1.6 kb的t PA-DLL4-6His目的片段,测序结果表明,与NCBI数据库中的DLL4序列(NM_019074.3)相同。一步亲和纯化后,得到纯度为95%的DLL4蛋白,Dot blotting和Western blotting检测到发酵上清液中含有DLL4蛋白,DLL4蛋白和DLL4抗体之间的亲和力在1.848E-10,R2=0.999,ELISA法获得DDL4抗体效价为1∶12 800,Western blotting检测DLL4抗体具有良好的特异性。成功制备出具有免疫原性的DLL4蛋白及其多克隆抗体。