PaP3噬菌体57kD蛋白编码基因的确定

分离鉴定了PaP3噬菌体57 kD蛋白的编码基因并对其功能进行了初步探讨。用PEG沉淀结合CsCl梯度密度离心分离、纯化噬菌体颗粒,通过SDSPAGE分析该噬菌体的衣壳蛋白,转印PVDF膜后,对57 kD蛋白用Edman降解法进行N端氨基酸测序,进而从PaP3全基因组的256个ORFs中确认该蛋白质的编码基因及其对应的氨基酸序列。结果显示噬菌体PaP3有9种结构蛋白分子,其中57 kD蛋白是由ORF34793编码的。57kD蛋白编码基因全长1542bp,G+C百分含量为49.16%,编码514个氨基酸。该蛋白分子量为57.4kD,等电点为5.879。实验表明该蛋白是一种结构性蛋白,很可能是噬菌体衣壳蛋白中的一种壳微粒。     

重组人肽抗生素hPAB—β及其突变体的活性测定与筛选

从人体基因组中克隆了一个编码肽抗生素样的基因。按基因编码产物的氨基酸序列 ,化学合成目的产物 ,药物敏感测定法证实产物具有杀菌活性后 ,又用基因工程法人工表达了目的产物。测定表达的重组人肽抗生素hPAB β及其突变体的抗菌活性 ,筛选理想的活性分子。方法是应用平板法和最小抑菌浓度 (MinimumInhibitionConceng tration ,MIC)测定法检测重组表达的hPAB β及突变体hPAB β38,hPAB β34对 8株实验室保存菌株及 10株临床分离菌株的杀菌能力 ,并以化学合成的肽抗生素hPAB β作对照 ;根据各目的分子抗菌能力的强弱 ,筛选理想的目…     

人源肽抗生素hBD—2表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了构建人源肽抗生素hBD－2的表达质粒燕在大肠杆中表达,将化学合成的hBD-2全基因原核融合蛋白靛质粒pinpointXa-3的多克隆位 构建成表达质粒,按常规方法转化大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子并诱导融合蛋白的表达,结果经酶切鉴定获得7个阳性克隆,序列分析表明其中4个克隆的插入序列与hBD-2基因完全一致,另3个克隆插入序列的39位由C突变为5T,89 多了一个Go,正确的阳性克隆子在大肠杆菌中产生了约18kD的特异性诱导蛋白,hBD-2的成功表达为进一步研究hBD-2的抗菌活性,抗菌机理打下了一定的基础。     

嗜酸乳酸杆菌ATCC 4356菌株异源二聚体b-半乳糖苷酶的克隆表达

嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)的异源二聚体β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶2家族,由两个部分重叠、协同翻译的基因编码(lacL和lacM).[目的]克隆表达该酶并测定其酶学特性.[方法]参照已全基因组测序的嗜酸乳酸杆菌NCFM菌株,以嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株基因组为模板,将lacL的RBS到lacM的终止子之间的序列(2834 bp)克隆到pQE31质粒上,并电转化JM109菌株.以下列步骤纯化表达产物:硫酸铵分级沉淀、阴离子交换、亲和层析和凝胶排阻层析.以凝胶排阻层析测定纯化酶的天然分子量,以邻硝基苯基半乳糖为底物测定其酶学特性.[结果]实现了该酶在JM109菌株中的可溶性表达.其氨基酸序列有一处不同于嗜酸乳酸杆菌NCFM菌株,即其大亚基(LacL)的第512位氨基酸不是组氨酸而是精氨酸.纯化酶比活力为226 U/mg蛋白,天然分子量为96.3±4.6 kDa,最适pH为7,最适温度为49℃,Km和Vmax值分别是:2.18±0.12 mmol/L,273±5 U/mg蛋白.