胸腺肽α1-Spl DnaX内含肽融合蛋白的切割动力学研究

目的:研究胸腺肽α1(Tα1)与Spl DnaX内含肽融合蛋白AS的体外切割动力学。方法:构建Tα1和SplDnaX内含肽的融合表达载体pET-AS,转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导获得可溶性表达的融合蛋白AS,用镍亲和层析纯化该蛋白;综合评价温度、β-巯基乙醇(β-ME)浓度和诱导切割时间对Spl DnaX内含肽介导融合蛋白AS自切割释放Tα1的影响。结果:在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白AS,经镍柱纯化获得该蛋白;随着温度升高和β-ME浓度增加,诱导切割时间延长,Spl DnaX内含肽介导的切割率逐渐增大;最终采用300 mmol/Lβ-ME切割24 h,融合蛋白的硫解切割率大于90%。结论:通过对Spl DnaX内含肽的诱导切割条件进行摸索,确定了最适宜的切割条件,为利用该方法制备Tα1和其他小分子多肽提供了技术基础。     

重组人表皮生长因子的稳定性

考察了不同条件下重组人表皮生长因子（rhEGF）的稳定性。结果表明,不同的保存条件（物理状态、温度、pH、浓度等）对rhEGF的稳定性有显影响,使用适当的添加剂（保护剂、抗氧剂、抑菌等）可以提高rhEGF的稳定性。上述结果为rhEGF的制剂学研究提供了依据。     

用改良的MTT法测定rhG-CSF活性

ＭＴＴ测定法是根据线粒体脱氢酶催化ＭＴＴ形成蓝色甲■的多少来检测活细胞数和功能状态的,但原始方法中存在着一些问题,如敏感性偏低、有机溶剂产生蛋白质沉淀以及产物的溶解度偏低等。为了摸索测定 ｒｈＧ－ＣＳＦ活性的最适条件,我们以 ＮＦＳ－６０细胞为对象,比较了多种溶解缓冲液,并且对细胞数、ＭＴＴ浓度及保留时间、溶解液用量等条件进行了选择。结果表明,ＤＭＦ－２０％ＳＤＳ和 ２０％ＳＤＳ的效果最好,测定时细胞数为每孔 １０００个细胞,所加 ＭＴＴ浓度为 １ｍｇ／ｍｌ,保留时间为 ４ ｈ,溶解液的用量为每孔 １００μｌ。     

破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株构建

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良, 构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌, 该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的S. aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至E. coli BL21(DE3)的lpxM位点, 改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间, 这样可使宿主核酸免受该酶“毒性”影响, 菌体裂解后, nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。     

Scytovirin在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:获得Scytovirin(SVN)蛋白及其多克隆抗体.方法:按照NCBI上公布的SVN基因序列设计合成引物,合成SVN基因,构建pET32c-SVN原核表达重组质粒,经限制性酶切分析、DNA序列测定插入片段正确;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达;用离子交换层析法及金属亲合层析法纯化蛋白,采用Tris-Tricine系统分析;以经过纯化的蛋白为抗原免疫白兔,制备SVN多克隆抗体.结果:对表达产物进行了分离纯化,SVN纯度达到91%;用纯化的样品制备了多克隆抗体,抗血清效价为1∶102 400.结论:SVN在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并制备了其多克隆抗体,为进一步深入研究SVN提供了材料.     

rimJ基因缺失不影响大肠杆菌BL21(DE3)生长的温度敏感性

目的:研究rimJ基因对大肠杆菌BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性的影响。方法:利用SceⅠ-Red同源重组技术将大肠杆菌BL21(DE3)基因组中的rimJ基因缺失,得到rimJ缺失突变菌;比较缺失突变株和原始菌株在不同温度(25℃、37℃、42℃)下的最大比生长速率,利用统计学方法分析rimJ基因的缺失对BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性是否有影响。结果:rimJ基因被成功敲除;统计分析结果表明缺失突变株和原始菌株的最大比生长速率没有明显区别。结论:rimJ基因缺失对大肠杆菌BL21(DE3)生长的温度敏感性无影响。     

通过染色体整合表达古菌乙酰化酶合成N-末端乙酰化胸腺肽β4

胸腺肽β4（Tβ4）是N-末端乙酰化的43肽,具有多种重要生物学功能.其生物合成存在两大难点,即乙酰化修饰和小分子肽的表达.本研究发现来自古菌Sulfolobus solfataricus的乙酰化酶ssArd1可以催化Tβ4的N-末端乙酰化修饰.利用Red同源重组技术将ssArd1基因表达盒整合至E.coli BL21（DE3）染色体的lpxM位点上,构建了可以实现Tβ4N-末端乙酰化修饰的新型宿主E.coli BDA.将Tβ4编码基因融合在改造的微型Spl DnaX Intein的N端,并在Intein的C端添加His标签,构建了表达载体pET-Tβ4-Intein.在E.coli BDA中表达的融合蛋白,经镍亲和层析纯化后用β-巯基乙醇诱导融合蛋白切割释放小分子多肽,获得了具有N-末端乙酰化的Tβ4.     

血清学指标检验在脂肪肝患者临床诊断中的应用价值研究

目的:探讨血清学指标检验在脂肪肝患者临床诊断中的应用价值。方法:收集2013年3月-2014年3月于我院接受治疗的脂肪肝患者42例,作为观察组;选取同一时间我院体检科健康查体者42例,作为对照组。比较两组血清学指标检验结果,并分析其在脂肪肝临床诊断中的价值。结果:观察组患者丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平明显高于对照组健康查体者,两组比较差异均具有统计学意义(t=11.42、13.17,P0.05);观察组患者血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平明显高于对照组健康查体者,两组比较差异均具有统计学意义(t=7.35、8.02,P0.05)。结论:血清ALT、AST、TG、TC指标在脂肪肝患者临床诊断中存在重要的临床应用价值,可作为临床监测脂肪肝的重要方法,值得推广。     

持续皮下胰岛素注射对2型糖尿病合并肺部感染患者的疗效分析

目的:分析持续皮下注射胰岛素对2型糖尿病(T2DM)合并肺部感染患者的临床疗效。方法:将我院2010年6月至2013年6月收治的86例2型糖尿病合并肺部感染患者随机分为2组,分别采用胰岛素泵持续皮下注射(治疗组)和多次皮下注射胰岛素(对照组),观察患者血糖指标、血糖达标时间、低血糖发生率及肺部感染治愈率情况。结果:治疗后,两组患者的血糖均得到控制,治疗组的血糖指标变化、血糖达标时间及住院时间均优于对照组,差异均有统计学意义(均P0.05)。治疗组的低血糖发生率明显低于对照组,而肺部感染治愈率显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论:胰岛素泵持续皮下胰岛素注射在治疗2型糖尿病合并肺部感染患者中使用,血糖达标迅速,降低低血糖发生率,缩短住院时间,提高感染治愈率,临床效果好。     

化学切割重组融合蛋白制备人胸腺肽β_4

目的：在大肠杆菌中表达人胸腺肽β4（Tβ4）的融合蛋白,通过CDAP介导的化学切割将融合部分切除,获得人Tβ4。方法：分别以质粒pET-Tβ4和pET-L12为模板,扩增Tβ4和核糖体亚基蛋白L12的基因片段,再以这2段基因为模板进行重叠PCR,并在连接处引入一个半胱氨酸（Cys）密码子,将得到的融合蛋白Tβ4-Cys-L12基因片段与pET-22b载体连接,构建表达质粒,将其与N-末端乙酰转移酶质粒共转化至大肠杆菌BL21（DE3）并共表达,获得N端乙酰化修饰的融合蛋白Tβ4-Cys-L12;利用CDAP氰基化Cys的巯基,于pH10.0条件下在Cys残基N端完成切割,分离纯化获得Tβ4。结果：质谱分析目的产物相对分子质量为4962.70,与天然Tβ4一致,表明获得了Tβ4。结论：CDAP介导的化学法可以有效切割融合蛋白获得Tβ4,建立了一套Tβ4的生物制备方法。