泛素样蛋白ISG15抗病毒机制研究进展

ISG15(Interferon stimulated gene 15,ISG15)蛋白是由干扰素诱导产生的一种泛素样蛋白分子,分子量大小约为15kD。ISG15同泛素分子相类似可以被共价结合于其他蛋白分子上,这种现象称为ISG化(ISGylation)现象。ISG化系统包括ISG15、UBE1L、UBCH8和HERC5四类蛋白分子,协同完成ISG化过程。ISG15及ISG化系统在抗病毒反应中具有重要作用。近几年对于ISG15的抗病毒作用和机制的研究已经有了很大的突破,ISG15的抗病毒作用也越来越受到人们重视,了解清楚ISG15抗病毒机制对于研制新的抗病毒药物及提出新的抗病毒策略具有重要意义。本文对ISG15在不同种病毒中的抗病毒机制研究进展进行了简要综述。     

猪瘟病毒感染猪白细胞凋亡基因表达谱变化的研究

为了了解CSFV感染引起猪细胞凋亡的分子机制,利用基因芯片分析了猪感染CSFV前后基因组转录水平的变化。分离攻毒前和攻毒后猪外周血白细胞(Peripheral blood leucocyte,PBL),提取总RNA,经反转录和体外转录得到cRNA,与Affymetrix猪全基因组cDNA芯片进行杂交分析,筛选差异表达的凋亡基因。结果显示,感染猪的PBLs中共筛选到24个涉及细胞凋亡有关基因发生2倍以上变化,并对差异表达的12个宿主细胞凋亡相关基因,用荧光定量RT-PCR进行了验证。功能分析显示,这些凋亡基因的表达变化与CSFV诱导宿主细胞凋亡的机制有关。本文首次用猪全基因组芯片研究了CSFV感染诱导宿主基因的表达变化,建立了CSFV感染猪细胞凋亡相关基因的表达谱,初步阐释了CSFV感染诱导宿主细胞凋亡的分子机制。     

乙型脑炎及其疫苗概况

乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的,在自然界中主要以鸟、猪为宿主,经蚊为主的虫媒传播的一种人兽共患传染病。该病主要流行于亚洲地区及环西太平洋地区,已成为人类脑炎疾病最主要的病因之一,严重威胁着人类健康,并影响畜牧业特别是养猪业的发展。WHO公布数据显示,每年大约有50 000例乙型脑炎患者,造成至少10 000例死亡及15 000例神精后遗症患者,但至今仍无有效的治疗措施,接种疫苗依然是预防JEV感染的最佳途径。介绍JE的流行病学特点,乙型脑炎的发病情况,重点综述国内外市场上使用的JE疫苗情况及其最新研究进程,希望对我国JE疫苗的使用及研发提供有益参考。     

埃博拉病毒NP蛋白的单克隆抗体制备及抗原肽的定位

埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)是一种能导致人类及脊椎动物出血热的致死性病毒,对公共卫生具有较严重的危害。EBOV的NP蛋白在病毒复制中具有重要作用,也是诊断该病重要的靶蛋白。文中原核表达重组扎伊尔型EBOV的NP蛋白,重组蛋白免疫bal/c小鼠,制备了一株小鼠抗EBOV-NP的单克隆抗体。利用Western blotting方法,该抗体能特异识别真核表达和原核表达的重组EBOV-NP,并能同莱斯顿型(RestonEbola virus,REBOV)、科特迪瓦型(Cote-d’Ivoire Ebola virus,CIEBOV)和本迪布焦型(Bundibugyo Ebola virus,BEBOV)埃博拉病毒产生交叉反应,而不与苏丹型(the Sudan Ebola virus,SEBOV)和马堡型(the Marburgvirus,MARV)埃博拉病毒产生反应。利用突变PCR和Western blotting方法,定位了该抗体识别的抗原决定簇序列,该序列(PPLESD)位于EBOV-NP蛋白的C端583-588aa。生物信息学研究表明,该序列在已经公布的ZEBOV、CIEBOV、BEBOV共16个型和REBOV的4个型中高度保守。研究结果为建立以上各型埃博拉病毒的检测方法提供了工具,也为研究埃博拉病毒复制及致病机理提供了基础。     

氧化苦参碱下调免疫细胞TLR7mRNA的表达

为了探讨氧化苦参碱对免疫细胞Toll-like receptor7( TLR7) mRNA表达的影响,使用CCK-8试剂盒检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞的生长抑制作用.应用荧光定量PCR方法检测氧化苦参碱对RAW264.7细胞TLR7 mRNA及其下游因子TNF-α mRNA表达的影响;检测氧化苦参碱对小鼠脾脏淋巴细胞TLR7 mRNA及其下游因子MyD88、TRAF-6 mRNA表达的影响.结果显示,氧化苦参碱对RAW264.7细胞的半数抑制率为5.9 mg/mL.氧化苦参碱下调RAW264.7细胞TLR7、TNF-α mRNA表达;下调小鼠脾脏淋巴细胞TLR7、MyD88、TRAF-6 mRNA表达.由此得出,氧化苦参碱可下调免疫细胞TLR7mRNA的表达.     

SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测埃博拉病毒方法的建立

为了建立一种快速准确的检测埃博拉病毒(EBOV)亚型的方法。本研究根据GenBank中公布的EBOV NP基因序列,通过设计引物和优化反应条件,建立了一种SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法检测EBOV。以体外转录的EBOV RNA为模板进行试验,该方法检测的灵敏度可以达到1.0×102个拷贝/μL,检测范围达到9个数量级为102～1010,可检测5种亚型EBOV。建立的方法对马尔堡病毒(MARV)、登革病毒(DENV)、新疆出血热病毒(XHFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、流感病毒(H1N1和H3N2)和猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)E基因组RNA无非特异性扩增。本文将荧光定量RT-PCR技术用于埃博拉病毒的定量检测中,并且建立了EBOV SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。     

甲型H1N1流感病毒HA基因在昆虫细胞中的截短表达

目的:利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表达重组HA蛋白,Western blot及IFA方法鉴定其表达。方法:采用PCR方法扩增A/California/04/2009(H1N1)HA基因,将其克隆到pFastBacHT A载体上,重组质粒pFastBacHT-HA经双酶切及测序鉴定正确后,转化阳性重组载体进入E.coli DH10Bac感受态细胞中,通过Bluo-gal蓝白斑筛选、PCR鉴定获得重组转座子rBacmid-HA。从重组转座子中提取rBacmid-HA质粒DNA转染sf 9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。重组杆状病毒感染sf 9细胞表达重组蛋白,Western blot及IFA鉴定重组蛋白表达情况。结论:成功构建了甲型H1N1流感病毒HA基因的昆虫杆状病毒表达载体,该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高,重组杆状病毒表达的重组蛋白经Western blot 及IFA 鉴定后具有良好的免疫反应原性。     

小鼠Toll样受体3基因的克隆及真核表达

采用RT-PCR方法从小鼠巨噬细胞中克隆小鼠Toll样受体3(TLR3)基因,基因测序表明获得了小鼠全长TLR3cDNA,构建了真核表达质粒p3XFLAG-CMV-7.1-TLR3.重组质粒转染293T细胞,Western blotting检测蛋白表达,表达蛋白质的相对分子量与预计相符.采用TLR3的阳性刺激物poly(I∶C)刺激重组质粒转染的293T细胞,双荧光素酶报告基因系统检测发现能激活下游转录因子NF-κB的转录活性,并能诱导TLR3下游细胞因子IL-6和TNF-α的表达.小鼠TLR3基因的克隆和表达,为研究TLR3介导的信号通路及其在抗病毒免疫中的作用打下基础.     

H3N2型猪流感病毒M2蛋白表达分析

流感病毒的M2蛋白在流感病毒复制中起着重要作用,是抗流感病毒的靶标分子。本研究以提取的病毒基因组RNA作为模板,RT-PCR扩增H3N2亚型猪流感病毒M2基因,分别构建了重组原核表达载体和重组真核表达载体,建立了M2蛋白的原核和真核表达系统。通过大肠杆菌表达系统,制备了M2重组蛋白,并免疫大鼠制备了多克隆抗体。Western blotting和间接免疫荧光方法检测表明所制备的抗体能识别真核表达的M2蛋白和病毒感染细胞后表达M2蛋白,具有良好的特异性。重组M2真核表达载体转染Vero细胞,表达的重组M2蛋白大小为20kDa,定位于细胞浆中,与病毒感染细胞中的M2蛋白定位相同。Western blotting检测表明M2蛋白在病毒感染细胞12h后才能检出,晚于NS1、NP和M1,属于病毒复制的晚期蛋白,可作为病毒复制晚期的指示分子。本研究为弄清M2蛋白在病毒复制过程中的生物学功能奠定了基础。     

EBOV-Z和MARV的NP基因在杆状病毒表达系统的表达及反应原性鉴定

利用昆虫杆状病毒表达系统,成功地对埃博拉(EBOV)扎伊尔型病毒和马尔堡病毒(MARV)的NP基因进行表达。Western blot结果显示,重组EBOV蛋白和重组MARV-NP与各自阳性血清有特异的反应原性,在血清学上无交叉反应。IFA检测感染重组昆虫杆状病毒的Sf9细胞表明,EBOV和MARV NP获得大量表达,呈现强烈的荧光,对照组细胞无特异荧光。该研究为EBOV和MARV流行病学调查和研制诊断试剂盒奠定了基础。