重症急性呼吸道感染患儿中人鼻病毒分型检测及流行病学分析

目的:调查重症急性呼吸道感染患儿中人鼻病毒(HRV)的感染情况,初步了解不同型别HRV流行病学和临床特点。方法:收集2008年5月至2010年3月北京儿童医院重症急性呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物样本259份,采用巢式PCR法,先用鼻病毒5′UTR引物筛查样本中该病毒总的感染情况,再用针对VP4-VP2区域的引物对阳性样本进行分型检测;同时对阳性样本进行其他常见呼吸道病毒共感染检测与流行病学及临床特点分析。结果:259例样本中,5′UTR初筛HRV阳性89例(34.4%),与其他常见呼吸道病毒存在共感染54例(60.7%);可通过VP4-VP2分型测序确定39例HRV-A(48.1%)、4例HRV-B(4.9%)、38例HRV-C(46.9%);HRV-A感染率最高的季节分布是秋季;HRV-A和HRV-C型感染者在临床特点上无明显差别。结论:HRV是儿童重症急性呼吸道感染的重要病原之一,新发现的HRV-C基因型感染率与HRV-A相似,但HRV在儿童重症急性呼吸道感染中的病原学意义还须进一步确认。     

2种检测人偏肺病毒感染的荧光定量PCR方法的应用比较

目的:比较基于人偏肺病毒(hMPV)N或L基因的2种检测hMPV感染的荧光定量PCR方法在207例临床呼吸道样本检测中的应用效果。方法:建立基于hMPV N或L基因片段的荧光定量PCR方法,检测2008年5月至2009年3月在北京儿童医院因急性呼吸道感染的住院患儿鼻咽拭子207份,比较2种方法检出率的敏感性和特异性。结果:在207份样本中,2种方法共检出38(18.36%)份阳性样本,基于N或L基因一种方法均检出32(15.46%)份阳性样本,总检出符合率为94.2%(195/207)。另外发现,基于L基因检测为阴性而基于N基因检测为阳性的样本在L基因与引物和探针结合的部分序列有核苷酸的突变。对19例阳性样本的F基因进行进化树分析发现,大多数hMPV属于A2和B2型,只有1例属于B1型。结论:2种荧光定量PCR方法的联合应用,对于临床样本中hMPV的检测更为敏感。     

HIV-1B′/C亚型Rev蛋白的表达、纯化与抗体制备

目的:为方便实验室工作中对HIV-1 B′/C亚型Rev蛋白的检测,制备相应的Rev蛋白及其抗体.方法:将我国HIV-1 B′/C亚型流行株的rev基因按大肠杆菌优势密码子进行改造后人工合成,在原核系统中与pET30a(+)载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达,目的蛋白经Ni2+金属螯合层析柱纯化后用于免疫家兔,制备多克隆抗体.结果与结论:合成基因在原核系统中融合表达得到相对分子质量约18×103的融合蛋白,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的36%;用纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹及间接免疫荧光检测结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1 B′/C亚型的Rev蛋白能产生特异性反应,可用于检测HIV-1 B′/C亚型Rev蛋白的表达.     

利用小鼠模型评价含有5＇-GTCGTT-3＇特征序列的人CpG寡脱氧核苷酸的免疫刺激活性

为了寻找合适的动物模型来评价人CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）的活性,研究了CpG2006等含有5＇-GTCGTT-3＇特征序列的人CpG-ODN对小鼠的免疫刺激活性。在体外它们能够促进小鼠脾淋巴细胞转化,促进B细胞分泌IgM,但不能诱生高水平的IFN-γ。研究了CpG2006等序列在体内作为疫苗佐剂对HBsAg免疫效果的影响,发现（1）人CpG-ODN能够明显提高抗-HBs抗体水平,并逆转Al（OH）     

儿童肺炎肺实变住院患儿支气管肺泡灌洗液病原分析

本研究分析肺炎肺实变患儿支气管肺泡灌洗液病原谱构成,旨在为临床经验性抗感染治疗提供指导。收集2019年1月-2020年1月复旦大学附属儿科医院纤维支气管镜室诊治的住院肺炎病例临床资料,其中肺实变的诊断基于影像学证据,依托国家儿童医学中心病原学检测平台,并参考感染传染科医生解读,本研究对肺炎伴肺实变患儿支气管肺泡灌洗液标本的病原学检测结果进行回顾性分析。结果显示,286例肺炎患儿的286份支气管肺泡灌洗液标本被纳入研究,平均年龄5.5(5.8±3.1)岁,其中195例(68.2%)存在肺炎伴肺实变。总病原体检出率为76.6%(219/286),肺实变和无肺实变肺炎患儿病原体检出率分别为77.9%(152/195)和73.6%(67/91),差异无统计学意义;检出的前5种病原体均为肺炎支原体、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型。5周岁及以上患儿肺炎支原体检出率达最高77.0%(127/165),肺实变病例和无肺实变病例肺炎支原体检出率分别为67.2%(131/195)和61.5%(56/91),差异无统计学意义。本研究结果提示,肺炎支原体、腺病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒3型是导致本研究目标人群患病的主要病原体;病原体检出率高低与是否肺实变无关。     

表达人冠状病毒NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒的制备与表达分析

HCoV-NL63是新近发现的人冠状病毒,对其外膜糖蛋白-棘突蛋白的表达及功能的研究仍有待深入。本研究利用天坛株痘苗病毒载体,克隆构建可表达HCoV-NL63棘突蛋白四个片段(N端棘突蛋白:S1;C端棘突蛋白:S2;受体结合区大片段:RL;受体结合区小片段:RS)的重组痘苗病毒(vJSC1175-S1;vJSC1175-S2;vJSC1175-RL;vJSC1175-RS),酶切测序证实表达载体构建正确,免疫荧光分析(IFA)各重组痘苗病毒中棘突蛋白不同片段的表达与定位,Western-Blot分析表明各种重组蛋白表达正确。分析结果显示:4种重组蛋白均能有效表达,S1、RL及RS蛋白的荧光主要分布在细胞膜上,而S2蛋白的荧光则主要分布于细胞浆,各个片段的分子量大小与文献报道相同,并可进行正确的翻译修饰(糖基化)。本研究首次采用痘苗病毒天坛株载体构建制备了表达HCoV-NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒,为进一步分析人冠状病毒HCoV-NL63棘突蛋白的结构功能及探索其抗原性和免疫原性奠定了基础。     

同时表达麻疹病毒L4株HA和F蛋白及人白细胞介素2(IL2)的重组痘苗病毒疫苗株的构建

构建了同时表达麻疹病毒ＬＡ株ＨＡ和Ｆ基因及人白细胞介素２（ＩＬ２）的重组痘苗病毒疫苗株ＲＶＪＭＬＨＡＦＫＩＬ２。Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ结果显示,ＨＡ、Ｆ和人ＩＬ２基因均在痘苗病毒中稳定有效表达,且产物与天然蛋白相近。ＨＡ分子有糖化的７９ｋＤ和非糖化的田ｋＤ两种形式;Ｆ分子以６０ｋＤ的前体Ｆ０、４３ｋＤ的Ｆ１和１８ｋＤ的Ｆ２三种形式存在。表达产物的血凝效价为１：８,血溶活性ＯＤ５４０的测定结果是Ｏ３７。该重组病毒免疫新西兰白兔及Ｃ５７小鼠,可以产生抗麻诊病毒ＨＡ和Ｆ蛋白的特异性ＥＬＩＳＡ（１：６４４～１６００）、血凝抑制（１：２５６～５１２）、血溶抑制（１：８０～１６０）和ＮＴ（１：６４０）抗体。接种兔及裸鼠后的毒力反应,明显低于只表达ＩＬ２的重组痘苗病毒疫苗株ＲＶＪ１２３,表现为兔皮肤红肿范围小,持续时间短,皮肤无坏死;裸鼠毒力的结果,表现出ＲＶＪＭＬＨＡＦＫＩＬ２病毒只存留于接种局部,而且滴度大大降低,未发现该病毒向其它脏器播散和增殖。麻疹重组痘苗病毒疫苗株的构建为该疫苗株的人体免疫观察奠定了基础。     

非复制重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒Bostwana C亚型Nef蛋白及免疫效果的观察

从含人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)Bostwana C亚型全基因的质粒pJM4-HIV中克隆了nef基因,并利用非复制型痘苗病毒载体构建表达Nef蛋白的重组病毒NTVJ1175nef,经PCR和Southern blot鉴定,nef基因正确整合到痘苗病毒基因组的J片段上;感染人源细胞后,经Western blot和免疫荧光检测表明,重组病毒能很好地表达Nef蛋白,并定位于细胞质中.NTVJ1175nef免疫BALB/c小鼠后,经Pep-IFN-'γ-Assay法检测,可诱导产生针对表位肽P1特异的可分泌IFN-'γ的C 8 T细胞(占脾细胞总数0.20%);经乳酸脱氮酶(LDH)法检测证实,诱导的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性地杀伤表位肽P1特异P815靶细胞.这些结果表明,NTVJ1175nef具有良好的细胞免疫原性,为下一步构建表达包含HIV早期抗原的多组分重组痘苗病毒候选疫苗奠定了免疫学基础.     

人免疫缺陷病毒早期蛋白Nef的表达、纯化及免疫原性研究

目的：通过原核细胞表达人免疫缺陷病毒（HIV）Nef抗原,制备特异抗血清,为Nef抗原检测提供技术方法。方法：以HIVBotswana毒株基因组为模板,用PCR法获得Nef蛋白编码基因,将其克隆到pET30a载体中,在大肠杆菌中表达Nef融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清,用真核表达的Nef抗原对其特异性进行分析。结果：构建的Nef融合基因在大肠杆菌中获得表达,相对分子质量约为36x103,免疫BALB／c小鼠获得针对融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1：6400;免疫荧光和Westemblot检测表明,该抗血清能特异地与重组痘苗病毒表达的Nef抗原反应。结论：在大肠杆菌中表达了HIVNef融合蛋白,制备了Nef融合蛋白的高效价小鼠免疫血清,该血清能特异性识别HIVNef抗原,为HlVNef抗原检测提供了技术方法。     

痘苗病毒基因组密码子使用频率分析

密码子使用的差别是普遍存在的现象,每一个密码子被某些生物偏爱,而在另一些生物中则很少使用.以往这方面的研究多集中在自养生物中,而对纯寄生的病毒本身及其与宿主细胞基因密码子使用频率关系的研究则很少.分析痘苗病毒哥本哈根株189个基因的密码子使用频率发现:总体上痘苗病毒偏爱使用以A/U为结尾的密码子;基因的异质性不强,没有影响密码子使用的主要趋势;在不同转录方向上和表达时相上,基因密码子使用略有不同;不同功能的基因其密码子使用上差别较大;晚期基因比早期基因与宿主密码子使用频率的差别大.上述结果表明:密码子是影响病毒和细胞相互作用、保证其自身生存的重要机制.