粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶的分离纯化及酶学性质研究

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育所得的漆酶高产菌株,Active-PAGE分析表明SAH-12在高氮低碳无机盐培养液(LM3)中至少分泌3种漆酶同工酶(Lac1、Lac2、Lac3)。采用硫酸铵盐析、透析和Sephadex-G75分子筛层析从其培养液中分离纯化得到电泳纯的Lac1,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。Lac1经SDS-PAGE验证为一条带,其表观分子量为61.5kDa。Lac1为一种糖蛋白,含糖量11.6%,等电点pI4.40,催化氧化底物ABTS的最适反应温度为60℃,最适pH为2.6,Km值为25μmol/L。Lac1在40℃(pH4.0)以下和pH1.5～5.0(28℃)范围内稳定。金属离子Fe2+、Ag+、Hg2+和Cr3+与抑制剂DTT、SDS、EDTA和DMSO对Lac1有抑制作用,其中Fe2+和DTT完全抑制酶活,而Cu2+对酶有明显激活作用,Mn2+、Zn2+对酶活影响不大。Lac1不仅可使一些合成染料明显脱色,而且对苹果汁多酚祛除也有较好效果。40℃用该酶(1U/mL)处理苹果汁5h,其多酚含量可降低40%。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶的分离纯化及酶学性质研究

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育所得的漆酶高产菌株,Active-PAGE分析表明SAH-12在高氮低碳无机盐培养液（LM3）中至少分泌3种漆酶同工酶（Lac1、Lac2、Lac3）。采用硫酸铵盐析、透析和Sephadex-G75分子筛层析从其培养液中分离纯化得到电泳纯的Lac1,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。Lac1经SDS-PAGE验证为一条带,其表观分子量为61.5kDa。Lac1为一种糖蛋白,含糖量11.6%,等电点pI4.40,催化氧化底物ABTS的最适反应温度为60℃,最适pH为2.6,Km值为25μmol/L。Lac1在40℃（pH4.0）以下和pH1.5～5.0（28℃）范围内稳定。金属离子Fe2＋、Ag＋、Hg2＋和Cr3＋与抑制剂DTT、SDS、EDTA和DMSO对Lac1有抑制作用,其中Fe2＋和DTT完全抑制酶活,而Cu2＋对酶有明显激活作用,Mn2＋、Zn2＋对酶活影响不大。Lac1不仅可使一些合成染料明显脱色,而且对苹果汁多酚祛除也有较好效果。40℃用该酶（1U/mL）处理苹果汁5h,其多酚含量可降低40%。     

植酸酶phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyA^m重组于大肠杆菌表达载体pET-30b（＋）,以重组表达载体pET30b-FphyA^e为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyA^m（在植酸酶基因C端增加了来源于pET-30b-FphyA^m载体上13氨基酸残基）。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA^e在GS115酵母中表达。纯化的突变酶pp-NP^e与野生型酶PP-NP^m-8相比：PP-NPA^e的最适反应温度上升了3气,75℃处理10min,热稳定性提高21％,比活力略有提高。最适反应pH为5．6,有效pH范围pH4,6到pH6．6。比未突变酶扩大了0.4单位。     

植酸酶phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyA^m重组于大肠杆菌表达载体pET30b(+),以重组表达载体pET30b-F-phyA^m为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyA^e（在植酸酶基因C端增加了来源于pET-30b-F-phyA^m载体上13氨基酸残基）。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA^e在GS115酵母中表达。纯化的突变酶PP-NP-e与野生型酶PP-NP-m8相比：PP-NPAe的最适反应温度上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高21%,比活力略有提高。最适反应pH为5.6,有效pH范围pH4.6到pH6.6。比未突变酶扩大了0.4单位。     

F43Y及I354M,L358F定点突变对植酸酶热稳定性及酶活性的改善

对重组酵母PPNPm8的植酸酶phyAm基因进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354、358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F),得到了2个突变体PPNPm-1(F43Y)及PPNPm-2(I354M,L358F).含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAm-1,pPIC9kphyAm-2在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物进行酶活性测定及热稳定性检测.结果表明:突变体PPNPm-1最适反应温度比未突变体PPNPm8上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高15%,比活力提高11%;PPNPm-2最适反应温度未改变,热稳定性比PPNPm8仅提高3%,比活力降低6.5%.对突变前后的植酸酶空间结构进行比较预测,发现突变氨基酸Tyr43与空间位置相邻的Asn416之间形成氢键,增强了酶的热稳定性.     

氨基磁性微球固定化木瓜蛋白酶及其应用

目的:采用实验室自制氨基磁性微球固定化木瓜蛋白酶,并将其应用于啤酒中蛋白质的水解.方法:考察不同给酶量、戊二醛浓度、固定时间等因素对固定化木瓜蛋白酶的影响.将固定化酶用于啤酒的处理,测定其游离氨基酸变化.结果:实验表明给酶量1.2mg/ml,戊二醛浓度5%,固定化时间4h为固定化最佳条件.酶活力测定表明,在最优化条件下制备的固定化酶较溶液酶具有更低的Km值(0.489%:3.412%),更好的酸碱(6.8:7.2)和温度耐受性(77℃:67℃),操作和储藏稳定性也得到了很大提高.固定化酶水解啤酒中蛋白质后,啤酒混浊度降低了0.013个单位,酪氰酸和苯丙氨酸等游离氨基酸有不同程度的增加,啤酒色泽和口味得到了改善.结论:磁性固定化木瓜蛋白酶较溶液酶有更佳的稳定性和更好的可操作性,具有广泛的应用前景.     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育得到的漆酶高产菌株。为了对其漆酶基因进行研究和利用,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,从T.gallica诱变菌株SAH-12分离得到漆酶基因全长cDNA Lacc1(GenBank accession No.DQ431716)及其对应的结构基因Lac1(DQ431715)。该基因属于真菌漆酶基因家族,与来自出发菌T.gallica漆酶基因lacA(AY875867)在成熟肽编码区的同源性最高(一致性为98%)。Lacc1全长1891bp,由40bp的5'-UTR、1554bp的完整ORF和297bp的3'-UTR构成,具有polyA加尾信号AATACA和59bp的polyA结构;其完整ORF可编码21个氨基酸残基组成的信号肽和496个氨基酸残基组成的成熟蛋白。在Lacc1基因的推导氨基酸序列中有4个潜在的N-糖基化位点和4个参与二硫键形成的Cys残基,且含有真菌漆酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型铜离子结合区的4个高度保守序列。结构基因Lac1全长2338bp,含10个内含子和11个外显子,各内含子长度在51bp~76bp之间,且其序列均符合5'-gt…ag-3'规则。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育得到的漆酶高产菌株。为了对其漆酶基因进行研究和利用,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,从T.gallica诱变菌株SAH-12分离得到漆酶基因全长cDNA Lacc1(GenBank accession No.DQ431716)及其对应的结构基因Lac1(DQ431715)。该基因属于真菌漆酶基因家族,与来自出发菌T.gallica漆酶基因lacA(AY875867)在成熟肽编码区的同源性最高(一致性为98%)。Lacc1全长1891bp,由40bp的5'-UTR、1554bp的完整ORF和297bp的3'-UTR构成,具有polyA加尾信号AATACA和59bp的polyA结构;其完整ORF可编码21个氨基酸残基组成的信号肽和496个氨基酸残基组成的成熟蛋白。在Lacc1基因的推导氨基酸序列中有4个潜在的N-糖基化位点和4个参与二硫键形成的Cys残基,且含有真菌漆酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型铜离子结合区的4个高度保守序列。结构基因Lac1全长2338bp,含10个内含子和11个外显子,各内含子长度在51bp~76bp之间,且其序列均符合5'-gt…ag-3'规则。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶的分离纯化及酶学性质研究

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育所得的漆酶高产菌株,Active-PAGE分析表明SAH-12在高氮低碳无机盐培养液（LM3）中至少分泌3种漆酶同工酶（Lac1、Lac2、Lac3）。采用硫酸铵盐析、透析和Sephadex-G75分子筛层析从其培养液中分离纯化得到电泳纯的Lac1,纯化倍数6.54,酶活性回收59.7%。Lac1经SDS-PAGE验证为一条带,其表观分子量为61.5kDa。Lac1为一种糖蛋白,含糖量11.6%,等电点pI 4.40,催化氧化底物ABTS的最适反应温度为60℃,最适pH为2.6,Km值为25μmol/L。Lac1在40℃（pH4.0）以下和pH1.5～5.0（28℃）范围内稳定。金属离子Fe²⁺、Ag⁺、Hg²⁺和Cr³⁺与抑制剂DTT、SDS、EDTA和DMSO对Lac1有抑制作用,其中Fe²⁺和DTT完全抑制酶活,而Cu²⁺对酶有明显激活作用,Mn²⁺、Zn²⁺对酶活影响不大。Lac1不仅可使一些合成染料明显脱色,而且对苹果汁多酚祛除也有较好效果。40℃用该酶（1U/mL）处理苹果汁5h,其多酚含量可降低40%。     

超氧化物歧化酶全酶和脱辅基酶胍变性时失活与去折叠的比较研究

利用紫外差吸收光谱和荧光发射光谱等监测手段研究天然铜锌ＳＯＤ和脱铜锌ＳＯＤ在不同浓度胍溶液中的去折叠及活力变化。结果表明ｈｏｌｏ－ＳＯＤ和ａｐｏ－ＳＯＤ分别在４．０和２．０ｍｏｌ／Ｌ胍溶液中去折叠,而分别在２．０和０．５ｍｏｌ／Ｌ胍溶液中其构象尚未发生明显改变时活性几乎完全丧失。提示金属离子对维持酶的整体及活性部位构象具有重要作用,脱去金属离子的酶分子的构象特别是活性部位的构象更易受到变性剂的破坏