嵌合猪圆环病毒PCV1-2的构建及其感染性初步鉴定

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)是当前严重危害养猪业的重要病原之一。目前,世界上还没有有效疫苗用于该病毒的免疫预防。该研究利用PCR方法,将PCV2的ORF2基因替换猪Ⅰ型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,构建了以PCV1基因组为骨架的嵌合病毒(PCV1-2)分子克隆(pSK2PCV1-2)。将该分子克隆转染PK-15细胞并连续盲传5代,用RT-PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV1的ORF1 mRNA和PCV2的ORF2 mRNA,但检测不到PCV1的ORF2 mRNA和PCV2的ORF1 mRNA。间接免疫荧光检测显示在盲传第5代的细胞中有PCV2 ORF2蛋白的表达,表达蛋白主要分布于细胞核。该研究初步证实构建的PCV1-2分子克隆转染细胞后可以形成具有感染性的嵌合病毒,从而为更深入研究嵌合病毒生物学特性奠定了基础。     

猪1型圆环病毒全基因组克隆及其感染性初步鉴定

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)是由Tis-cher等[1]于1974年在PK-15细胞中发现,当时认为是一种细胞污染物,后被证实为一种新的病毒。病毒粒子为20面体对称,无囊膜,以滚环方式进行复制,可在PK-15细胞上生长但不引起细胞病变。其基因组是一种环状、单股副链DNA,与鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)、鹦鹉喙羽病毒(psittacine beak and feather disease circovirus,PBF-DAV)和人的TT病毒(transfusion transmittedvirus,TTV)同属圆环病毒科。猪圆环病毒有两种基因型即:PCV1和PCV2。前者广泛存在于猪源肾细胞中,在猪的组织…     

猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(porcine circovirus type 2,PCV-2)全基因组序列,设计一对PCV-2特异性引物,用该室分离的PCV-2豫A株感染PK-15细胞,从中提取PCV-2复制型基因组DNA,并以之为模板进行PCR扩增.回收PCR产物,构建重组测序质粒T-PCV-2.测序结果表明,猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组为1767bp,与GenBank收录的PCV-2国外分离株核苷酸的同源性可高达97%.序列分析表明,复制型豫A株的基因组包含10个读码框架,其中ORF1、ORF2是其两个最主要的读码框架,分别编码314、234个氨基酸.豫A株和PCV-1间的ORF1、ORF2的氨基酸序列同源性分别为85%、66%,与其它PCV-2毒株间的ORF1氨基酸同源性均在98%以上,而ORF2的氨基酸同源性为92%～97%.     

中国小反刍兽疫疫情分析

为分析中国PPRV毒株分子演变特点和疫情传播路线,从NCBI下载中国和世界其他国家全部PPRV毒株N和F基因全序列,应用分子生物学软件,并结合疫情发生的地理位置进行系统分析。结果显示,中国西藏阿里地区PPRV毒株之间核苷酸同源性为100%,其与西藏那曲地区毒株核苷酸同源性为99.9%;中国毒株与其他国家毒株F基因核苷酸序列分析显示,同源性为89.7%～98.8%,同源性最低的为科特迪瓦1989年毒株,同源性最高的为孟加拉国2010年毒株;N 基因核苷酸序列分析显示,同源性为69.5%～98.5%,同源性最低的为朝鲜2002年毒株,同源性最高的为印度1995年毒株;F和N 基因系统进化关系分析均显示,中国西藏3株PPRV均属于基因Ⅳ系;截止2014年3月30日,中国由西至东9省份发生该疫情。更加全面的分析结果,有待于更多PPRV流行毒株N或F基因全序列在GenBank的公布。     

猪Ⅱ型圆环病毒全基因组的克隆及感染性鉴定

设计合成一对扩增猪Ⅱ型圆环病毒（PCV2）全基因组的特异性引物,从3份患断奶后仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）的死亡仔猪病料中,PCR扩增和克隆了3株PCV2全基因组序列。将所测序列与已公布的PCV毒株序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株间的核苷酸同源性为957%～994%,与其它毒株的同源性较高,达951%以上;ORF1的核苷酸同源性高达978%以上,氨基酸同源性大于98%;ORF2的核苷酸同源性较低,为90%～98%不等,推导的氨基酸序列同源性介于87%～991%。进化树分析表明各分离毒株在进化上存在地域上的相关性。将克隆到的PCV2基因组环化后,脂质体介导转染PK15细胞,盲传3代。间接免疫荧光检测表明,克隆到的基因组具有感染性。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF1基因克隆及在E.coli中的表达

猪圆环病毒(porcinecircovirus ,PCV)属圆环病毒科(Circoviridae) ,为单股负链DNA病毒,以滚环方式进行复制,是目前已知的最小的动物病毒之一.PCV有2种基因型即PCV 1和PCV 2 ,两者细胞培养均不引起病变.前者广泛存在于猪源肾细胞中,但并不引起感染猪发病,其基因组为1 75 9bp ;后者首先由Allan等[1 ] 从患断奶猪多系统衰弱综合症(postweaningmultisystemicwastingsyndrome ,PMWS)的猪群中分离到,被证明为PMWS的重要病原.PCV 2主要侵害感染猪的免疫系统[2 ] ,从而诱发猪体的免疫抑制.PCV 2常和呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)…     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

湖北省神农架林区野猪分布与传播非洲猪瘟风险分析

野猪是非洲猪瘟(ASF)传播的重要媒介,神农架林区野猪种群数量高、分布广,调查野猪分布对ASF防控有着重要意义.本研究首先通过布设红外相机117台、样线287条调查神农架林区野猪实体和痕迹位点后,应用最大熵模型预测林区野猪分布,再根据野猪、居民区、交通要道的空间分布数据,应用核密度估计法分析神农架林区各地野猪传播ASF...