小鼠RHOX5蛋白两种截短型突变体的原核表达及其与MDFIC互作的鉴定

目的：表达和纯化两种小鼠RHOX5蛋白的截短型突变体,确定完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。方法：生物信息学分析小鼠同源异型框蛋白RHOX5的cDNA序列,分别对RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C进行PCR、分别扩增RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C并将其克隆至pGEX4T3原核表达载体,构建重组表达质粒。用重组表达质粒分别转化大肠杆菌RosettaTM2(DE3)菌株,经IPTG诱导后,使用Glutathione-Sepherase 4B颗粒对融合蛋白进行小批量亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳分离目标蛋白,确定融合蛋白的表达。进行GST-pull down实验,检测完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。 结果：在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中有效地实现了GST-RHOX5、GST-RHOX5 N和GST-RHOX5-C-3种融合蛋白的可溶性表达;经Glutathione Sepherase 4B颗粒亲和纯化后,获得了纯化后GST融合蛋白;GST-pull down实验证实,含有homeodomain的RHOX5蛋白和RHOX5C截短型突变体可以与MDFIC蛋白相结合,而RHOX5N截短型突变体则丧失了与MDFIC蛋白结合的能力。 结论：实现了RHOX5及其两种截短型突变体的原核表达和纯化,证实RHOX5蛋白的homeodomain结构域是其与MDFIC结合的关键部位。     

鞘脂激活蛋白原Prosaspoin与Rhox5间的功能性相互作用

鞘脂激活蛋白原(prosaposin)是一种多功能的糖蛋白。除作为鞘脂糖水解途径中所涉及到的溶酶体酶的激活剂外,其在神经系统、生殖系统及前列腺癌的发生中都担当重要角色。利用酵母双杂交系统筛选与Rhox5蛋白相作用的分子,获得一个阳性克隆No.1-14,序列比对表明其是prosaposin(Psap)的C末端。进一步的研究表明,全长的prosaposin(不含外显子8的剪接本)亦可以与Rhox5相互作用。暗示prosaposin(Psap)的C末端可能是Psap与Rhox5相互作用的关键结构。由于Psap与Rhox5均在生殖系统的发生、发展和分化,精子的生成和成熟中发挥重要作用,Psap与Rhox5相互作用的证实提示两者可能共同参与雄性生殖系统发生的动态调控。     

黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室

黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室隶属于牡丹江医学院．建立于2000年．是黑龙江省“十五”期间首批普通高校重点建设实验室,2006年10月．经黑龙江省教育厅验收成为黑龙江省普通高校组织损伤与修复重点实验室。2007年12月,经黑龙江省科技厅批准为黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室。重点实验室以建设组织损伤与修复、抗纤维化生物治疗平台为重点．构建基础医学、分子生物学、细胞生物学、药学相结合的新科研平台。     

孕期大鼠暴露PFOS对胎鼠肝脏毒性的影响

目的:研究在孕期暴露PFOS对胎鼠的肝脏毒性的影响.方法:将孕期为12天的16只SD雌性大鼠,随机分为4组给予不同剂量的PFOS[0(对照),5,10,20 mg·kg-1],连续灌胃7天,在GD19天时对母鼠和胎鼠的体重、胎鼠肝脏的生化指标、母鼠血清的生化指标进行了相应的检测.结果:与对照组相比,母鼠体重在20 mg·kg-1组显著下降(P＜0.001);胎鼠的体重和体长在20mg·kg-1组显著下降(P＜0.001);胎鼠的肝脏重量降低,呈剂量依赖性,并伴有肝细胞浊肿、变性甚至坏死;10 mg· kg-1组胎鼠肝脏中的酶活性(ALT、AST、GGT和ALP等)显著升高(P＜0.001);母鼠血清的大部分生化指标未发生明显变化.结论:孕期大鼠暴露在PFOS的环境下会严重损伤胎鼠的肝脏功能.     

Mdfic与Rhox5蛋白相互作用的关键结构域鉴定

Mdfic（MyoD family inhibitor domain containing）是一个新发现的含有MyoD抑制素结构域（I-mfa domain）的转录调控因子,可能在肌细胞的分化过程中发挥重要作用. 小鼠Rhox5为同源异型框基因,隶属于Rhox基因簇（reproductive homeobox on the X chromosome genes cluster）β亚簇.在前期证实Mdifc能结合Rhox5蛋白的基础上,进一步鉴定两者相互作用的关键结构域.生物信息学分析Mdfic 的氨基酸序列,PCR方法扩增Mdfic A截短型片段（第72～247位氨基酸残基）,含保守的I-mfa结构域; 双向酵母双杂交和体外GST-Pull down结果表明,该截短型片段可以与Rhox5蛋白结合,且结合力度较完整的Mdfic蛋白强; 将Mdfic A片段划分为两段: Mdfic B（72～191 aa, 不含I-mfa结构域）和Mdfic C（191～247 aa, 含I-mfa结构域）.结果表明,含保守I-mfa结构域的Mdfic C截短型片段丧失了与Rhox5蛋白结合的能力,而不含I-mfa结构域的Mdfic B截短型片段可以结合Rhox5蛋白. 鉴于Mdfic蛋白的非I-mfa结构域在Rhox5/Mdfic结合中发挥关键作用, Rhox5与Mdfic的结合可能进一步调控由Mdfic的I-mfa结构域参与的其他转录因子（如MyoD）的调控,三者形成一个复杂的调控网络,共同参与肌细胞发生及分化的调控.     

全氟辛烷磺酸盐对胚胎期大鼠雄性生殖系统的影响

目的:研究全氟辛烷磺酸盐(PFOS)对胚胎期大鼠雄性生殖系统发育的影响.方法:PFOS分别以5、10、20 mg· kg-1·d-1灌胃染毒孕12-19天的SD母鼠,染毒结束后,测量雄性胎鼠体重、身长、睾丸重量、AGD;酶联免疫吸附法检测雄性胎鼠睾丸内睾酮水平;实时荧光定量PCR法测睾丸组织类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、胰岛素样因子3(INSL3)mRNA的相对表达量.结果:与对照组相比,高剂量染毒组雄性胎鼠体重、体长、AGD长度显著降低(P＜0.01),睾丸重量减轻(P＜0.05);高剂量染毒组雄性胎鼠睾丸中内睾酮水平下降(P＜0.05);高剂量染毒组雄性胎鼠睾丸组织中StAR mRNA的表达量降低(P＜0.05),而中剂量染毒组StAR mRNA和INSL3 mRNA表达量则明显升高(P＜0.01).结论:孕期染毒PFOS对雄性胚胎生殖系统的发育有毒性作用,其机制可能与PFOS影响睾酮合成和INSL3 mRNA的表达有关.     

重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对肝纤维化大鼠的治疗作用研究

目的:研究截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对肝纤维化大鼠的治疗作用。方法:取含有重组截短型TGF-βⅡ型受体载体的大肠杆菌BL21,通过培养繁殖,诱导,纯化得到重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白。使用CCl4诱导的方法来制备肝纤维化大鼠模型,观察截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对大鼠肝纤维化的影响。SDS-PAGE检测纯化的截短型TGF-βⅡ型受体蛋白。生化检测血清谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,ALT)及谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,AST)含量。用实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法和免疫荧光方法来检测各组大鼠肝组织中的α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA),1型胶原(collagen1,Col1)和4型胶原(collagen4,Col4)的表达情况。用HE,MASSON,PAS这三种病理学染色的方法来观察各组大鼠肝纤维化的变化。结果:SDS-PAGE检测结果显示,纯化后获得高纯度截断型TGF-βⅡ型受体蛋白。截短型TGF-βⅡ型受体蛋白治疗组可以减少血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量。截短型TGF-βⅡ型受体蛋白治疗组可以降低肝组织中α-SMA、FN、Col1和Col4的mRNA和蛋白质的表达。三种病理学染色的方法显示,与肝纤维化大鼠模型组相比,治疗组的纤维化程度明显减轻。结论:重组截短型TGF-βⅡ型受体蛋白对大鼠肝纤维化的程度有抑制作用,为治疗肝纤维化及其他纤维化疾病提供了一个潜在的治疗手段。     

突变型人HGF(tvNK1)对CCl_4诱导的大鼠肝纤维化的影响

目的:探讨突变型人肝细胞生长因子(HGF~(K132E,R134E),tvNK1)对四氯化碳(CCl_4)诱导的SD大鼠肝纤维化的影响。方法:生物发酵大量制备tvNK1,并经腹腔注射于CCl_4诱导的纤维化SD大鼠体内,6周后取肝脏组织,通过real-time PCR和Western blot检测tvNK1对纤维化SD大鼠肝脏中I型胶原蛋白(Collagen type I,Col1A1)、IV型胶原蛋白(Collagen type IV,Col4A1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)在mRNA和蛋白水平表达的影响,并进一步通过HE和Masson染色观察tvNK1对纤维化SD大鼠肝脏形态和肝组织胶原纤维的影响。结果:SDSPAGE检测结果显示,获得纯度≥95%的tvNK1。Real-time PCR和Western blot结果显示,tvNK1降低纤维化大鼠肝脏中Col1A1、Col4A1和α-SMA在mRNA和蛋白水平上的表达。HE和Masson染色结果显示,tvNK1减缓纤维化大鼠肝结构的病理性改变,并降低肝脏中胶原纤维含量。结论:tvNK1能抑制CCl_4诱导的大鼠肝纤维化,为预防肝纤维化和其他器官纤维化疾病提供实验依据。     

一种新型的截短型转化生长因子βⅡ型受体在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

克隆人源的截短型转化生长因子βⅡ型受体（tTGF-βRⅡ）,成功构建高效稳定的大肠杆菌表达菌株。采用PCR技术扩增得到目的基因tTGF-βRⅡ,插入原核表达载体pGEX4T3的相应位点,并在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高可溶性表达的重组蛋白,重组蛋白GST-tTGF-βRⅡ经Glutathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后,再经凝血酶酶切,然后经Glutathione-Sepharose 4B纯化获得目的蛋白tTGF-βRⅡ,SDS-PAGE分析表明：可以通过Glutathione-Sepharose 4B亲和层析纯化得到GST-tTGF-βRⅡ,其分子量约37.0 KDa,和目的蛋白tTGF-βRⅡ,分子量为11.0 KDa。Western blot结果显示GST-tTGF-βRⅡ和tTGF-βRⅡ为特异性蛋白。运用基因工程的方法获得tTGF-βRⅡ目的蛋白,对瘢痕成纤维细胞增殖具有很好抑制作用。     

miR-23b通过靶定TAB2/3抑制糖尿病肾病纤维化

MicroRNAs(miRNAs)通过与靶基因的相互作用发挥其生物学功能. miR-23b作为抑癌基因,参与了许多肿瘤和自身免疫疾病的发生过程,但其在糖尿病肾病中的作用尚不清楚.为了探讨miR-23b与靶基因TAB2/3作用对糖尿病肾病纤维化的影响,本实验通过建立糖尿病小鼠模型和糖尿病HK-2细胞模型,利用实时定量荧光PCR方法,检测糖尿病小鼠模型肾mRNA表达,发现miR-23b在糖尿病组（Dia组）表达低于正常组（P<0.001）.利用Western印迹检测相关蛋白,结果显示,与正常组相比,TAB2/3,FN和α-SMA在糖尿病组高表达,并且TAB2/3在糖尿病组中持续高表达.利用基因转染技术过表达miR-23b可以同时在mRNA和蛋白水平上抑制TAB2/3,P38和ERK1/2的表达,FN表达也显著降低.以上结果显示：miR-23b可能通过作用靶基因TAB2/3及其信号通路下游,抑制糖尿病肾病纤维化.