人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化和活性鉴定

为了延长人睫状神经营养因子突变体的体内半衰期 ,将人血清白蛋白 (HAS)的C 末端和人睫状神经营养因子突变体AX15 (R13K)的N 末端通过一个 11个氨基酸的连接肽融合在一起 ,构建了融合蛋白HAS-AX15 (R13K)。HAS-AX15 (R13K)融合蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中进行表达后通过阳离子交换层析、反向层析和凝胶过滤对表达产物进行了分离纯化。体外TF 1细胞存活实验表明与HAS融合并未影响AX15 (R13K)的生物学活性。体内动物实验表明HAS-AX15 (R13K)融合蛋白的疗效比AX15 (R13K)更为持久 :每 3天注射一次 4 8mg/kg的HAS-AX15 (R13K)融合蛋白的治疗效果优于每天注射一次 1 6mg/kg的AX15 (R13K)的治疗效果。HAS-AX15(R13K)融合蛋白不但可以减少用药次数 ,提高病人的顺应性 ,而且还可以减少用药量和血药浓度的波动 ,从而降低副反应 ,在临床应用上具有一定的优势。     

多形汉逊酵母研究进展

作为研究甲醇代谢、过氧化物酶体稳态和硝酸盐吸收的模式生物,多形汉逊酵母近年来在基础研究领域日益受到重视。在工程应用领域,利用多形汉逊酵母表达真核外源基因有特殊的优势。譬如容易得到高拷贝,在含油酸的培养条件下能够表达膜蛋白等。已有多种外源蛋白在多形汉逊酵母系统中得到表达。本文综述了多形汉逊酵母的基本生物学性质、基础研究领域概况及其在外源基因表达方面的特点和进展。     

分子伴侣对可溶性肿瘤坏死因子相关促凋亡配体在巴斯德毕赤酵母中表达的影响

目的:提高外源蛋白可溶性肿瘤坏死因子相关促凋亡配体(sTRAIL)在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。方法:根据GenBank公共数据库中公布的模式生物酿酒酵母的分子伴侣(Ssa1p、YDJ1、Kar2p和PDI)基因序列设计引物,利用PCR方法从酿酒酵母基因组中得到各基因片段,并将单独Ssa1p或Kar2p、组合YDJ1 PDI、Kar2p PDI或YDJ1 PDI PDI分别构建到pPIB2Z表达载体中,并整合到外源蛋白sTRAIL工程菌(毕赤酵母GS115)中进行筛选和诱导表达。结果:SDS-PAGE分析表明,sTRAIL的表达量明显提高,特别是整合了分子伴侣组合YDJ1 PDI的工程菌。Western印迹分析整合的分子伴侣基因后,分子伴侣蛋白在工程菌中的表达量得到了提高。结论:提高细胞内分子伴侣的表达,可以增加外源蛋白的分泌表达,为进一步研究巴斯德毕赤酵母奠定了基础。     

分子伴侣及信号肽对毕赤酵母中分泌蛋白表达水平的影响

目的：探索定位于细胞质、内质网膜及内质网腔中的分子伴侣及其组合对于带有不同信号肽的胞外β-1,3-葡聚糖酶（EXGl）在巴斯德毕赤酵母GS200中表达水平的影响。方法：通过融合PCR技术分别构建带有酵母a交配因子引导肽序列（仅MF）、酵母仅交配因子信号肽序列（ccPre）和重链结合蛋白（Bip）信号肽序列的报告蛋白EXGl的表达质粒pPIC9-EXG1,同时构建分子伴侣基因及其组合的表达质粒pBLArg-IV,然后将2种重组质粒共转化至毕赤酵母宿主菌GS200,转化子经筛选获得共表达菌株,通过测定EXG1酶活来评价分子伴侣与信号肽对其表达水平的影响。结果：细胞质及内质网膜上的分子伴侣Sec61a、Sec61B及胞质中的分子伴侣Ydjl、Ssal、Hsp104及其组合对各种信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平没有显著影响。然而,内质网腔中的分子伴侣Bip、EroI、PDI与HacI组合能显著提高报告蛋白EXG1的表达水平,其中,以aMF或ctPre作为信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平分别提高了2．6倍和3．8倍,以Bip信号肽引导的报告蛋白EXGl的表达水平提高了20％～45％,而对于以EXG1自身信号肽引导的报告蛋白EXG1的表达水平没有显著影响。结论：在酵母表达体系中,内质网腔中的分子伴侣是报告蛋白EXG1表达水平的重要影响因素．但分子伴侣对于信号肽的选择性还须进一步证明。     

EB病毒及其疫苗的研究进展

EB病毒广泛存在于人群中,它的潜伏感染与多种疾病密切相关,包括鼻咽癌等恶性肿瘤,研制疫苗用于EB病毒相关疾病的预防和治疗十分必要。本综述了EB病毒的结构及基因表达特点、EB病毒潜伏期感染基因表达及潜伏期基因产物的功能,以及研制EB病毒疫苗的靶抗原的选择。     

蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

AX15是一种比天然睫状神经营养因子具有更高的生物学活性、更好的稳定性和可溶性的hCNTF突变体。在巴斯德毕赤酵母中表达时AX15易发生降解。氨基酸序列分析表明降解位于由12和13位氨基酸残基组成的双碱性氨基酸之后。根据KEX2蛋白酶的底物专一性把双碱性氨基酸从RR变为RK,构建了KEX2抗性的AX15突变体AX15（R13K）。AX15（R13K）的稳定性得到了显著的提高,在诱导100 h后也未发生降解。利用超滤浓缩和凝胶过滤得到了纯度>90%的AX15（R13K）。TF-1细胞存活实验表明AX15（R13K）具有与AX15相同的生物学活性。蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体可能具有更好的体内稳定性,在临床应用上具有潜在的优势。     

中国生理学会中医生理学专业委员会“全国中医药创新与发展研讨会”纪要

为了迎接中国加入WTO后的中医药界所面临的机遇和挑战,积极推进中医药、中西医结合事业的现代化进程,加速中医药、中西医结合科技创新,中国生理学会中医生理学专业委员会、中华中医药学会养生康复专业委员会和中国残疾人康复协会中医康复专业委员于     

胃肠道肿瘤抗胃泌素治疗研究进展

胃泌素是胃窦和十二指肠黏膜G细胞分泌的多肽类激素 ,主要生理作用是促进胃酸分泌和胃肠道黏膜细胞生长。研究显示胃泌素是胃肠道肿瘤细胞一种自泌性的生长因子 ,通过促进增殖、抑制凋亡、刺激浸润以及和COX-2协同作用促进肿瘤生长。胃肠道肿瘤抗胃泌素治疗途径分为分泌抑制、受体拮抗、反义寡核苷酸抑制和抗胃泌素抗体治疗。其中抗胃泌素抗体治疗具有诸多优点 ,临床研究进展顺利。     

不同分泌信号对豹蛙酶在巴斯德毕赤酵母中分泌效率的影响

目的：研究不同分泌信号对豹蛙酶（ONC）在巴斯德毕赤酵母中分泌效率的影响。方法：根据已知天然ONC的氨基酸序列,结合酵母偏爱密码子,设计并合成了ONC基因序列,通过融合PCR获得了不同分泌信号与ONC的融合基因,将其克隆至表达载体pPIC9k中,然后将线性化的重组表达载体电击转化GS115毕赤酵母感受态细胞,通过SDS-PAGE检测目的蛋白表达量。结果：糖基化ONC表观相对分子质量为（14～16）×103,且其糖基化不均匀,非糖基化蛋白肽链的相对分子质量约为12×103;采用不含EAEA结构的α交配因子作为分泌信号时ONC没有表达,利用含EAEA结构的α交配因子和α交配因子的pre肽作为分泌信号时均能够显著提高其表达量。结论：采用含EAEA结构的α交配因子和α交配因子的pre肽作为分泌信号均能够显著提高ONC在巴斯德毕赤酵母中的表达量。     

人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的表达及鉴定

化学合成人甲状旁腺激素（hPTH）全长基因,克隆到大肠杆菌表达载体pBV220和pET22b中,获得了高表达。经破菌、阳离子交换层析、反相层析纯化获得了纯度大于95%的纯品。N端测序、质谱分析结果表明重组hPTH 结果完整,N端无Met或fMet。生物活性试验证明重组hPTH具有激活腺苷酸环化酶、增加骨质量和骨密度等作用。