重组腺相关病毒介导的大鼠脂联素载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠脂联素基因(Acrp30),并对载有脂联素的重组腺相关病毒(AAV)载体进行构建及鉴定.方法:根据Acrp30的基因序列设计引物,上游引入EcoR Ⅰ位点,下游引入Sal Ⅰ位点,以EX-A0242-M01-Acrp30为模板扩增目的基因.将Acrp30基因克隆入pUC19载体中,获得重组质粒pUC19-Acrp30.然后用EcoR Ⅰ与sal Ⅰ酶切pUC19-Acrp30及质粒pSNAV,回收酶切片段,T4DNA连接酶16℃过夜,转化大肠杆菌DH5a感受肽细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-Acrp30,EcoR Ⅰ/Sal双酶切鉴定,并行全基因测序.结果:PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-Acrp30重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的Acrp30基因正确.结论:脂联素病毒栽体成功构建,可以满足脂联素基因研究和治疗的需要.     

生长抑素受体基因特异性shRNA慢病毒表达质粒的构建

目的:设计并合成生长抑素受体SSTR5基因siRNA序列,并构建其短发夹shRNA慢病毒表达质粒.方法:以小鼠SSTR5基因为靶序列,用在线软件分析、设计并合成其有效siRNA,退火形成双链DNA后,与经BamH I和EcoR I双酶切线性化慢病毒表达载体pSHR-Pμro/GFP连接,产生pLV-shSSTR5重组慢病毒质粒.将重组质粒转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.结果:构建的重组表达质粒PCR产物为161bp,其中插入的SSTR5-siRNA片段为61bp,测序结果与参考序列完全一致.结论:成功构建了小鼠SSTR5基因特异性shRNA慢病毒表达质粒,为进一步采用RNAi技术研究小鼠SSTR5基因表达对其生长情况的影响奠定了基础.     

人HIF-1α miRNA干扰质粒的构建及其在Lovo细胞中有效性的检测

目的:构建人HIF-1α的miRNA特异性干扰表达载体并转染人结肠癌Lovo细胞检测其有效性.方法:设计合成针对人HIF-1α基因的特异性miRNA前体寡核苷酸,依次通过退火、连接,构建含HIF-1α前体miRNA的重组干扰质粒pcDNA?6.2-GW/EmGFP-HIF-1α-miR,并转染人结肠癌Lovo细胞,经半定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性.结果:经双酶切及测序鉴定,针对人HIF-1α基因的两组miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制人结肠癌Lovo细胞中HIF-1α mRNA表达.结论:成功构建针时人HIF-1α基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续HIF-1α基因慢病毒miRNA表达载体的构建及其在结肠癌多药耐药中的相关功能研究奠定基础.     

水蛭素明胶微球的制备及体外释放的考察

目的:制备重组水蛭素(rHV2)明胶微球,达到减少胃肠道对其降解和破坏的目的.方法:采用明胶为载体材料,用注入法制成重组水蛭素(rHV2)明胶微球,并考察微球形态、粒径和体外释放情况.结果:制成的明胶微球平均粒径为54.40μm,三批微球的rHV2含量为(2.60±0.05)mg,载药量为(2.67±0.05)mg,包封率为(54.60±1.09)%.三种不同固化时间制备的rHV2明胶微球体外释放试验情况一致,30 min释放量能达到50%,60 min能达到80%以上.结论:结果显示制备的重组水蛭素明胶微球基本达到要求.     

苏云金芽胞杆菌重组工程菌研究进展

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)可以产生对多种农业害虫有毒性的晶体蛋白(Insecticidal crystal protein,ICP),是目前世界上使用范围最广、应用最成功的杀虫微生物.已经发现苏云金芽胞杆菌可以对包括鳞翅目、鞘翅目、直翅目等在内的9个目500多种昆虫具有杀虫活性①,同时对某些螨类、吸虫、鞭毛虫及动植物线虫也有一定的活性.     

球形芽胞杆菌C3-41磷酸果糖激酶的克隆、表达及基本生物活性

[目的]球形芽孢杆菌缺乏EMP、HMP、ED途径的关键酶,如磷酸果糖激酶等被认为是其不能以糖类物质进行生长的主要原因.杀蚊球形芽孢杆菌C3-41全基因组序列分析表明,在染色体DNA上存在的磷酸果糖激酶基因pfk,为了进一步分析球形芽孢杆菌糖酵解途径,进一步确定磷酸果糖激酶在糖酵解途径中的功能.[方法]通过pfk基因在球形芽孢杆菌菌株中的Southern-blot拷贝数鉴定,在C3-41pfk基因克隆的基础上进行pfk基因在大肠杆菌中的融合表达、序列分析和序列比对等方法进行研究.[结果]证明了球形芽孢杆菌pfk基因由960 bp核苷酸组成,表达42 kDa的PFK融合蛋白,有保守的底物结合域和ATP结合域,同时pfk基因重组表达质粒可以回复大肠杆菌pfk缺陷型菌株DFl020代谢糖的能力.[结论]杀蚊球形芽孢杆菌C3-41的pfk表达产物具有磷酸果糖激酶活性,为今后深入研究球形芽孢杆菌产能代谢机理奠定了基础.     

置换HN基因对新城疫病毒LaSota株致病力的影响

[目的]新城疫病毒的血凝素.神经氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)在病毒装配、出芽、释放及侵入宿主细胞的过程中发挥关键作用,但HN对病毒致病力的影响程度尚不完全清楚.[方法]为探讨这一问题,本研究以中等毒力毒株Mukteswar的HN基因替换我国广泛应用的LaSota疫苗株HN基因,通过反向遗传操作技术拯救出嵌合病毒(rL-MuHN).[结果]rL-MuHN红细胞吸附能力较亲本株rLaSota无显著升高,具有相似的细胞融合活性;嵌合病毒ICPI由rLaSota株的0.36降为0,MDT≥90,IVPI=0与rLaSota株相同,保持典型低致病力缓发型特点不变.进一步以Mukteswar株F基因替换rL-MuHN的F基因,拯救出F和HN双基因替换嵌合病毒rL-MuFHN,尽管该病毒的细胞融合能力显著提高,但其MDT、ICPI和IVPI分别为98 h,0.59和0,显示F和HN双基因替换仍未能使嵌合新城疫病毒rL-MuFHN的致病力达到中等毒力毒株Mukteswar(MDT、ICPI及IVPI分别为46 h、1.32和0.64)的水平.[结论]试验结果表明,F及HN囊膜蛋白基因之外的病毒基因组骨架背景对病毒的致病性同样具有重要的决定性意义,不同HN蛋白对嵌合病毒的致病能力的影响不同,与供体毒株毒力无关;以流行野毒株HN替代rLaSota疫苗株构建抗原针对性更强的弱毒疫苗株存在技术可行性.     

禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突变株的构建 及部分生物学特性的分析

基于禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因的已知序列,利用入噬菌体的Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌国内分离株A2（血清型O2：K89）Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株A2△fimH：：Cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20（温度敏感性）以去除上述缺失突变株中抗性基因标志,结合PCR扩增和测序结果,证明fimH基因缺失株A2AfimH的正确构建。通过fimH基因互补试验使A2afimH缺失突变株恢复了与野生株具有相同的凝集活性。红细胞和酵母细胞凝集试验结果表明,野生株呈现良好的凝集效果,并能被0．5％甘露糖完全抑制,而A2afimH缺失突变株未呈现任何凝集现象。体外生长试验结果表明,在同样的培养条件下,A2afimH缺失突变株生长周期的各个阶段都要稍慢于野生株。禽致病性大肠杆菌国内分离株Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株成功构建,为进一步深入研究禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制,肠道外感染的致病机理及对国内禽大肠杆菌病的防控策略奠定了一定基础。     

白地霉Y162脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

借助生物信息学,对已克隆的地霉属脂肪酶全长基因序列进行同源比对,根据保守序列设计引物,在基因组DNA和cDNA水平上,于国内首次克隆了Geotrichum candidum Y162脂肪酶基因.Gcandidum Y162脂肪酶基因全长1692bp,不含内含子,编码包括19个氨基酸信号肽在内的563个氨基酸.与NCBI GenBank中已报道的地霉属脂肪酶氨基酸序列有86%的一致性.将该基因克隆到pPIC9K表达载体上,转化毕赤酵母GS115,摇瓶发酵96h后毕赤酵母分泌表达55 U/mL重组脂肪酶,实现了脂肪酶的高效表达.酶学性质研究表明,该重组脂肪酶对C9位顺式双键的甘油酯具有明显的底物特异性;对甲醇、甘油等有机溶剂呈现耐受性;最适温度和最适pH分别为50℃和8.0,在pH6.0～10.0及60℃以下能保持60%以上的酶活力.底物特异性、有机溶剂、温度及pH耐受性赋予该重组酶良好工业应用潜力.     

产单核细胞李斯特菌actA/plcB缺失株的构建及其生物学特性

产单核细胞李斯特菌的毒力因子与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而广谱磷脂酶C则参与具有双层膜吞噬体的裂解过程.[方法]本研究中利用同源重组技术成功构建了毒力因子ActA和PC-PLC双缺失的突变株,[目的]并对突变株的毒力和免疫应答潜能进行评价.[结果]Western blot和磷脂酶活性测定实验,分别从蛋白质水平上证实actA和plcB基因的缺失.突变株的毒力显著降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株提高约10 3倍,但仍然保持较好地诱导T细胞应答的能力,并且能完全保护野生型细菌致死剂量的攻击.实验结果不仅表明ActA和PC-PLC是产单核细胞李斯特菌的重要毒力因子,而且证实安全性提高的突变株依然保持有较强地诱导细胞免疫应答的能力.[结论]因此,该突变株的获得不仅对李斯特菌病的预防具有重要作用,而且为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础,此外对于阐明LM毒力因子的致病机理与免疫保护作用提供了条件.