人白血病抑制因子在原核细胞中的表达与纯化

研究证明人白血病抑制因子(hLIF)是一种对多种不同类型的细胞和组织具有重要功能的细胞因子,其独特的生物学特性使其被广泛应用。介绍了自制的具有生物活性的hLIF,将hLIF基因克隆到pET32a中,并利用硫氧还蛋白(Trx)作为融合配体,在大肠杆菌中成功表达可溶性融合蛋白Trx-hLIF。亲和层析纯化后利用SDS-PAGE和Western blot对纯化结果进行检验。利用肠激酶(EK酶)切割融合蛋白,释放hLIF,随后通过简单的阳离子交换得到纯度高达98.1%的hLIF4.75mg。小鼠M1髓系白血病细胞增殖分析测定纯化的rhLIF的功能与hLIF具有相似的生物活性,EC50为5ng/ml,对应的比活性为0.5×107 IU/mg。     

野生稻基因导入系W6023对白叶枯菌的抗谱及转录组差异表达基因分析

水稻白叶枯病是世界性水稻病害,严重威胁水稻的高产和稳产。为了挖掘水稻抗白叶枯病新基因,本研究对一个野生稻基因导入系W6023进行了白叶枯病多菌系接种鉴定及抗谱分析,发现W6023具有广谱抗病性。用强致病菌PXO99诱导W6023及其感病轮回亲本IR24后进行转录组测序,分别获得105644962和91022599条序列,通过GO注释及KEGG富集分析,发现差异表达基因主要富集在次生代谢产物的生物合成、植物激素信号转导及糖代谢途径等方面。在这些差异表达基因中,发现203个基因的表达有显著差异,其中在W6023中上调表达的基因有114个(56.2%),下调表达的有89个(43.8%),而且35.9%分布在第11染色体上。生物信息学分析发现在203个差异表达基因中有16个属于类抗病基因,如NBS-LRR等;14个直接或间接与水稻体内过氧化物的代谢相关,如编码过氧化物酶和金属硫蛋白等;6个编码抗病相关转录因子,如WRKY和NAC等;18个为信号传导相关基因,编码钙调素结合蛋白和萜类合成酶等。随机选择6个W6023中上调表达和3个IR24中上调表达的基因进行RT-PCR及qRT-PCR分析,结果与转录组测序结果一致,表明本研究获得的转录组测序数据结果是可靠的,为以后更深入挖掘W6023的抗病基因及分子机理研究提供了基础。     

同源过表达BglR对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性的影响

目的:克隆嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila ATCC42464)bglr基因,构建Mtbglr过表达载体,研究同源过表达bglr对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性及总纤维素酶活性的影响。方法:利用SLIC技术构建Mtbglr过表达载体;使用MtPpdc启动子及MtTpdc终止子将该基因进行同源过表达;利用原生质体转化、实时荧光定量PCR和酶活测定等技术实现bglr基因在嗜热毁丝霉中表达及酶活水平的鉴定。结果:成功构建Mtbglr过表达载体,并转化嗜热毁丝霉,结果表明,诱导培养条件下,转化子Mt8菌株的β-葡萄糖苷酶活性和胞外蛋白质浓度分别是WT菌株的1.7倍和1.9倍。结论:bglr基因对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性具有增强作用,为嗜热真菌β-葡萄糖苷酶基因调控奠定了理论基础。     

优质L-天冬酰胺酶的开发与应用及重组表达研究进展

L-天冬酰胺酶用于治疗急性淋巴细胞白血病与淋巴瘤,但高昂的价格限制了临床上的广泛应用,重组表达解决了成本的难题。L-天冬酰胺酶所具有的低谷氨酰胺酶活性是其副作用的根源,同时细菌来源的L-天冬酰胺酶能导致危及生命的过敏反应,寻找副作用更低的优质L-天冬酰胺酶及其修饰方法,成为研究的重点。对L-天冬酰胺酶的重组表达,及具有更优性质的L-天冬酰胺酶开发进展进行了综述,并阐明其在临床治疗及食品工业领域的巨大应用潜力。     

密码子优化后的αB-晶状体蛋白基因毕赤酵母重组质粒的构建及表达的初步研究

αB-晶状体蛋白属于小热休克蛋白家族,具有分子伴侣活性。在阿尔茨海默病大脑中,星形胶质细胞表达的αB-晶状体蛋白明显上调,并且这些上调的αB-晶状体蛋白紧密地分布在β-淀粉样蛋白沉积周围。为了在分子水平上研究胞外αB-晶状体蛋白在阿尔茨海默病中的作用机制,需要获得大量具有生物学活性的αB-晶状体蛋白。根据毕赤酵母密码子偏好性对人αB-晶状体蛋白基因进行优化,并在目的基因3'端加上6个组氨酸标签,优化后的基因克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体p PIC9K上;电转入毕赤酵母GS115中;优化确定最佳表达条件为:BMGY与BMMY的转接比为2∶1,表达时间为72h,甲醇补加终浓度为0.5%;经Western blotting鉴定,获得20kDa的目的蛋白,以及18.6kDa和13.1kDa两个蛋白质片段,重组目的蛋白出现了部分降解,纯化获得20kDa目的蛋白;利用胰岛素还原法测定该片段具有分子伴侣活性,为进一步研究外源αB-晶状体蛋白在阿尔茨海默病中对星形胶质细胞的保护机制奠定基础。     

非限制性内切核酸酶Sma的表达纯化工艺及性能研究

目的:大量表达非限制性内切核酸酶Sma并获得高纯度目的蛋白,对其酶活进行鉴定。方法:PCR获得Sma基因片段,构建pET28a-omp A-Sma表达载体,转入E.coli BL21(DE3)中,筛选出不同培养基下,目的蛋白可溶表达量最高的条件。通过渗透休克方法提取目的蛋白,并经离子交换纯化。检测不同的温度条件下Sma的酶活,并与商品化产品进行比较。结果:经PCR和测序证明重组蛋白表达质粒构建正确。可溶蛋白产量为7mg/L,每升培养基获得7 300k U的Sma,纯化后纯度95%,活性达273U/μl(商品化产品为250U/μl)。结论:成功地表达了可溶性非限制性内切核酸酶Sma,纯度高、活性好,各项条件下活性皆不低于商品化产品。     

斑马鱼转座子时空表达特性

转座子是基因组中可移动和扩展的元件,能够插入新的位点,影响基因组和基因的结构和功能,是基因组进化的内在驱动。为探讨转座子的时空表达特性,首先通过生物信息学方法鉴定出斑马鱼9个疑似活性转座子,包括DNA转座子Tc1家族(Tc-a、Tc-b、Tc-c、Tc-d、Tc-e)、反转录转座子ERV家族(ERV-1、ERV-2)和LINE家族(L1-323、L1-21),然后采用实时荧光定量PCR法检测上述转座子在斑马鱼早期胚胎发育7个阶段及成鱼各主要脏器的表达活性。结果表明:Tc1家族在0.75、2.00、3.00 h各阶段无转录活性,在6.00、15.00、24.00、48.00 h各阶段各转座子均有较高转录活性;反转录转座子转录活性最早出现于3 h,最晚出现于15 h,且随着发育时间的延长,转录活性显著增强。9种转座子在成鱼心脏、大脑、肌肉、肝脏、睾丸和卵巢均有表达,且大脑和心脏中的表达水平显著高于其他组织,睾丸表达水平最低。分析表明转座子的表达具有时间和组织的特异性,可能参与斑马鱼胚胎和组织器官发育调控,尤其是大脑和心脏发育。这些结果为进一步研究转座子是否具有基因表达调控功能提供重要参考。     

重组中华仓鼠卵巢细胞培养过程控制的研究进展

中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cells,CHO)是科研及生产中用于蛋白表达的常用体系。与大肠杆菌相比,CHO获得高表达的细胞株所需时间更长,蛋白产量更低。因此,大规模培养细胞所需的成本较高,培养条件也不易掌握。但该体系产生的蛋白纯度高,因而被广泛用于工业生产中。本文对CHO细胞的培养方式、pH值测定、渗透压、溶氧及培养液成分的选择等多方面条件进行综述,为优化中华仓鼠卵巢细胞培养的策略及具体方法提供理论依据。     

烟粉虱MED隐种气味结合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA克隆及原核表达

采用RT-PCR和RACE技术成功克隆烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA全长。BtabOBP2(Gen Bank登录号:AIS71883)和BtabOBP4(Gen Bank登录号:AIS71884)的cDNA序列全长分别为1107 bp和874 bp,完整开放阅读框(ORF)分别为744 bp和429 bp,分别编码247和142氨基酸,BtabOBP4有6个保守的半胱氨酸,属于典型OBP,而BtabOBP2除了具有典型OBP的6个半胱氨酸,增加了3个保守的半胱氨酸,属于Plus-C OBP。将得到的BtabOBP2和BtabOBP4重组到原核表达载体pET30a(+),转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导融合蛋白表达。采用亲和层析和凝胶过滤层析纯化融合蛋白,并进行Western blot分析。结果显示,BtabOBP2和BtabOBP4融合蛋白在大肠杆菌中均有可溶性表达,Western blot结果证实所表达的融合蛋白确实为目的蛋白。BtabOBP2融合蛋白在SDS-PAGE中的表观分子量比预测的分子量大了6.53 k Da,用重组肠激酶切掉6×His标签后,目的蛋白的表观分子量与预测分子量相近,偏差降低,说明6×His标签是造成融合蛋白表观分子量偏差的原因。本研究明确了烟粉虱气味结合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的核苷酸、氨基酸序列特征,并成功进行了原核表达和纯化,为进一步研究这两个OBP基因的分子结构和功能奠定了基础。     

意大利蜜蜂血淋巴HP19蛋白的表达及功能

昆虫血淋巴蛋白HP19主要参与蜕皮激素调控昆虫的变态及发育进程,蜂群内的工蜂、蜂王和雄蜂具有不同的变态和发育历期,为探究hp19在调控意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica三型蜂变态发育中的作用,本研究利用实时荧光定量PCR技术对hp19在不同发育时期的工蜂、雄蜂和蜂王体内的转录水平进行检测。结果表明,该基因在工蜂和雄蜂3龄幼虫体内表达量分别为参照基因的104和105倍,在5龄幼虫体内的表达则分别降为参照的10和102倍,蛹期表达量又都显著提高。hp19在蜂王整个幼虫期的表达保持在参照的102倍,封盖后逐渐上升,至化蛹前达到参照的105倍。在成年工蜂体内的表达为参照的104倍,而在新羽化蜂王和雄蜂体内表达水平为参照的107倍,但在性成熟的产卵蜂王和雄蜂体内的表达显著降低至参照的104倍。hp19在三型蜂体内这种不同的表达模式说明其不仅与三型蜂差异的变态发育历期有关,还可能与雄蜂和蜂王的生殖有关,具有多样的生物学功能。