SHIV1157ipd3N4细胞适应株的制备及其生物特性

目的体外制备SHIV1157ipd3N4病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性。方法用SHIV1157ipd3N4病毒阴道感染中国恒河猴,在血浆病毒载量高峰期采血分离外周血单核淋巴细胞（PBMCs）,与正常中国恒河猴PBMCs共培养。定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50。静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV1157ipd3N4在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性。结果本研究共制备了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液,gp120序列分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。病毒载量为1.586×108 copies/mL,P24抗原水平为1.16×103 pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL。1 mL SHIV1157ipd3N4静脉成功感染中国恒河猴G1004V,高峰期病毒载量达到1.0×106 copies/mL以上。结论此次制备的SHIV1157ipd3N4细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIV1157ipd3N4/中国恒河猴模型。     

西藏小型猪Leptin及其受体胞外区片段的克隆及原核表达

目的克隆及原核表达西藏小型猪瘦素（Leptin）成熟肽及瘦素受体胞外区片段。方法根据西藏小型猪瘦素序列（GenBank号：GQ240885.1）和猪瘦素受体基因胞外域序列（GenBank号：AF167719.1）分别设计并合成两对引物扩增瘦素、瘦素受体基因胞外域编码区1654-2319位片段,以西藏小型猪组织总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片段。再以该两个特异性片段为模板,另外设计两对带有BanHⅠ和HidⅢ酶切位点的套式引物分别扩增瘦素64-504位（成熟肽编码区）和瘦素受体基因胞外域编码区1655-2314位的cDNA片段,将该两片段克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌E.coli DH5α测序并永久保存。此两片段经酶切后克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,构建重组质粒pR-OB和pR-OBR-a并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果在IPTG诱导下促使重组菌pR-OB表达了相对分子质量约18×103左右的融合蛋白;重组菌pR-OBR-a表达了相对分子质量约27×103左右的融合蛋白。结论说明重组质粒pR-OB、pR-OBR-a在大肠杆菌BL21（DE3）中分别可表达西藏小型猪瘦素成熟肽、瘦素受体片段蛋白,为进一步研究瘦素、瘦素受体功能和应用提供了基础。     

一种比格犬雌二醇β受体剪切异构体的克隆和序列分析

目的分析比格犬下丘脑-垂体-性腺轴,雌二醇β受体剪切异构体的存在情况。方法根据NCBI数据库上的比格犬雌二醇受体的基因序列,设计两对特异性引物,以比格犬的卵巢、子宫、下丘脑和垂体的总RNA为模板进行反转录,并利用两对特异性引物扩增比格犬雌二醇受体的基因,对其中的主要条带进行克隆测序。结果获得了比格犬雌二醇受体的全长cDNA序列,对主要条带进行克隆测序的结果表明,该序列是一种比格犬雌二醇受体的剪切异构体。结论比格犬雌二醇β受体剪切异构体与小鼠和人的组成有较大的不同,需要进一步系统研究。     

荧光蛋白报告基因在植物寄生真菌研究中的应用

综述菌根真菌、植物内生菌和植物病原真菌等植物寄生真菌转荧光蛋白基因研究现状.介绍转化载体的构建、转化方法及特基因的检测方法,以及转荧光蛋白基因技术在植物寄生真菌侵染过程研究中的应用,指出真菌转荧光蛋白基因存在的问题和展望.     

盐藻酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

构建用于杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白(matrix attachment region binding protein,MBP)酵母双杂交试验的诱饵栽体,进行自激活及毒性验证.以含有盐藻MBP质粒为模板,经PCR扩增后连接pMD 18-T栽体,经测序鉴定正确后,EcoR Ⅰ/Nde Ⅰ双酶切获得目的基因MBP,克隆入经同样双酶切的酵母栽体pGBKT7,转化酵母菌株AH109及Y187,检测其自激活以及毒性.结果显示,成功扩增出盐藻MBP基因,重组质粒pGBKT7-MBP经酶切、测序表明序列正确,转化酵母菌株无自激活,无毒性.     

人热休克蛋白90AB1基因克隆、原核表达、中试发酵及纯化

通过克隆人热休克蛋白90AB1基因(Hsp90AB1),构建其原核表达载体pET28a(+ )-hHsp90AB1,表达纯化获得目的蛋白,为hHsp90靶向药物筛选奠定基础.提取宫颈癌HeLa细胞总RNA,并经RT-PCR获得hHsp90AB1-cDNA.以hH-sp90AB1-cDNA为模板进行PCR体外扩增,胶回收纯化hHsp90ABl.将hHsp90AB1及pET-28a(+)质粒经Nde I和Sal I双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化DH5α,经复苏后,在含卡那霉素的LB固体养基上筛选出阳性克隆.挑取LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实为阳性克隆,即pET28a-hHsp90AB1体外重组成功,命名为pET28a(+ )-hHsp90AB1.重组质粒转化Rosetta( DE3)菌株,IPTG诱导表达,并对表达条件优化,以及通过SDSA-PAGE和Western blotting分析均表明Hsp90AB1蛋白得到了正确的表达,且表达产物以可溶性形式存在,优化条件下蛋白表达量约占菌体总蛋白13％.接种到18 L发酵罐中试发酵,表达产物经Ni-NTA凝胶素和层析,蛋白纯度达到98％.     

Cyclin D1与细胞周期调控

细胞周期是细胞生命活动中一个最重要的过程,其关键是G1 期的启动.细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)和CDK抑制因子(CKIs)是参与钿胞周期调控的主要因子.Cyclin D1是调控细胞周期G1期的关键蛋白,是一个比其他Cyclins更加敏感的指标,对细胞周期调控至关重要.综述Cyclin D1的结构和功能及其在肿瘤组织中的表达特征,初步分析Cyclin D在昆虫细胞周期调控的研究.     

丽江云杉体胚发生过程差异蛋白分析

以丽江云杉非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织以及体胚发育过程的球型胚、鱼雷胚和子叶胚培养物为材料,采用双向电泳技术对体胚发生过程中特异表达蛋白进行分析.结果表明,丽江云杉非胚性、胚性愈伤组织及不同发育阶段体胚的蛋白质种类丰富(1 857-2 344个),胚性愈伤及发育体胚蛋白种类多于非胚性愈伤,球型胚蛋白种类最为丰富(2 344个).非胚性、愈伤组织及各发育阶段体胚共检测到44个差异表达蛋白,它们有明显的变化特点,子叶胚阶段的差异蛋白变化最为显著(23个,占特异蛋白总数的52.3％),鱼雷胚新出现大比例的分子量小于30 kD、pI为6.0左右的弱酸性小分子量特异蛋白(8个,占此阶段特异蛋白总数的88.9％),这些体胚发育晚期特异表达蛋白可能与体胚形态建成有密切关系.     

信号转导蛋白PⅡ的研究进展

PⅡ蛋白是一种信号转导蛋白,存在于细菌、古细菌和植物中,该蛋白通过调节信号传导酶的活性来控制细胞内的碳、氮代谢.就PⅡ蛋白的结构、功能以及在细菌和植物中PⅡ蛋白的研究进行了系统阐述.     

环鸟苷二磷酸代谢相关基因PXO03877的原核表达

分别利用表达载体pET-32a(+)和pGEX-4T-1,对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzzae v.oryzae,简称Xoo)中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PXO_03877进行了原核表达,并进行可溶性检测.结果显示,用pET-32a(+)栽体构建的表达质粒栽体经诱导后,重组蛋白大多位于沉淀而非上清中,经诱导条件优化后,蛋白仍以包涵体形式存在;而利用pGEX-4T-1载体表达的含有GST标签的重组蛋白为可溶性蛋白,可用于下一步纯化后进行功能分析.