黑色素皮质素受体激动剂的高通量筛选模型研究

为了建立黑色素皮质素受体（MC4R）激动剂的高通量筛选方法,将人的MC4R基因质粒（hMC4R/pCDNA3.1）与报告基因质粒（3×CRE/3×MRE/SRE-LUC）按1∶5的比例共转染到HEK293细胞,通过G418筛选,建立了稳定的MC4R激动剂筛选细胞株.利用MC4R内源激动剂α-MSH探索和优化了每孔接种细胞数目、激动剂孵育时间、溶剂DMSO终浓度、荧光素酶底物浓度等筛选条件,建立了可靠的筛选方法.实验表明：当细胞数目为4×10⁴个/孔,激动剂孵育时间为8 h,每孔DMSO终浓度小于1％和α-MSH终浓度为1 μmol/L时,系统Z'-因子接近0.7,能够用于MC4R激动剂的高通量筛选.     

山东太原组煤核中鳞木类茎--三点"鳞木"的解剖构造

描述了一种产自山东省南部的陶枣煤田和兖州煤田太原组煤核中的鳞木类茎的解剖构造特征.根据叶座的形态,该种茎曾被归入大青山"鳞木"("Lepidodendron"tachingshanense Lee)种,但此次重新仔细研究后转归三点"鳞木"("Lepidodendron",tripunctatum Stock.et Math.)种内.与欧美植物区和华夏植物区已有的具解剖构造的鳞木类茎进行了详细对比,认为与奇木属Diaphorodendron很接近,但叶座的形态和解剖差别较大.此外,当前标本的分枝方式还不清楚,因此,还不能将当前标本归入奇木属内.当前标本与奇木属的关系及其分类位置有待于今后对更多更好的标本进行深入研究.     

微管骨架在轮藻节间细胞伸长生长中的作用

利用免疫荧光定位及激光共聚焦扫描显微镜,结合细胞生长曲线的定量测定,对不同生长阶段的轮藻节间细胞微管骨架进行了观察研究,结果如下:轮藻顶端生长活跃的新生细胞中,与细胞长轴垂直的周质微管(cortical microtubules)占绝对优势,随着生长速率的减慢,周质微管由垂直于细胞长轴逐渐转为平行排列;基部生长基本停止的节间细胞中,胞内微管则以平行细胞长轴为主;不同生长阶段节间细胞的微管骨架,对微管特异解聚剂黄草消(oryzalin)处理的敏感性表现不相同。顶端生长活跃的节间细胞经oryzalin处理40min后,绝大多数周质微管发生解聚;而基部生长基本停止的老细胞中,即使延长处理时间,仍残留一些尚未完全解聚的微管片段;10μmol/L微管解聚剂oryzalin处理轮藻顶端新生细胞,在高精度的细胞伸长生长测定装置监测下,发现oryzalin对细胞的伸长生长速率有明显的抑制作用,去掉药剂后,伸长生长又有一定的恢复。并且发现,经o-ryzalin处理后,微管的解聚(40min左右)与顶端节间细胞伸长生长的停止(100min左右)两者间存在着时间上的差异,即微管解聚在先,细胞伸长停止在后。以上结果均说明微管骨架在轮藻节间细胞生长中具有重要作用。     

基因体外诱变的一种新方法

在PCR的过程中,采用5溴脱氧尿苷三磷酸（BrdUTP）部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的方法,对克隆的野油菜黄单胞菌的α淀粉酶基因进行了体外诱变。结果表明,BrdUTP浓度越高,诱变越强;浓度越低,诱变越弱。当BrdUTP浓度为dTTP的0.1%时,可以得到最多的正诱变结果。用LBSP鉴别培养基初筛,然后用Yoo改良法测定酶活,仅一轮诱变就获得了其表达产物α-淀粉酶的酶活分别降低了5倍和提高了20倍的两个突变基因。再以后者为PCR模板进行第二轮诱变,从而筛选到了α-淀粉酶的酶活提高40倍的突变体。此诱变方法克服了用碱基类似物在体内诱变由于核酸复制酶等的校正作用而造成诱变无效的难题,并为基因的体外诱变找到了一条新途径。     

芒果炭疽病菌β-微管蛋白基因的克隆及其与多菌灵抗药性发生的关系

参照豆科合萌属 (Aeschynomene)作物炭疽病菌的tub1和tub2基因序列设计了 2对引物 ,分别从芒果 (Man gifera)炭疽病菌对多菌灵 (MBC)田间抗药性 (MBCR)和敏感 (MBCS)的菌株中扩增 β_微管蛋白基因。结果只有以tub2为参照设计的引物扩增到了特异片段。进一步对全基因进行了克隆和测序。该基因序列全长 1344bp ,编码4 4 7aa ,其核苷酸和氨基酸序列与豆科合萌属炭疽病菌的tub2基因高度同源。对芒果炭疽病菌抗、感菌株 β_微管蛋白氨基酸序列进行比较分析 ,发现第 181、2 37和 36 3位氨基酸发生了突变 ,而其它位置 (如第 198位或 2 0 0位 )均不变     

利用绿色荧光蛋白基因gfp研究芽胞杆菌的启动子活性

利用绿色荧光蛋白基因gfpmut3,分别标记苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的cry3A启动子Pcry3A、BtI_BtII启动子PBtI_BtII和来自蜡状芽胞杆菌特异启动子P44-12以研究其表达差异。其中,Pcry3A和PBtI_BtII分别与gfpmut3构成融合基因,以调控gfpmut3在苏云金芽胞杆菌中的表达。将重组质粒pGFP_304(含P44-12)、pGFPExpA(含Pcry3A_ gfpmut3融合基因)和pGFPExpB(含PBtI_BtII_ gfpmut3融合基因)分别导入大肠杆菌(Escherichia coli)和苏云金芽胞杆菌后发现,P44-12和PBtI_BtII在大肠杆菌与苏云金芽胞杆菌中均可表达gfpmut3,其中PBtI_BtII在大肠杆菌中具有极强的启动基因表达的能力。而Pcry3A不能启动gfpmut3在大肠杆菌中表达,在苏云金芽胞杆菌中启动的gfpmut3表达的荧光强度也较弱。进一步通过荧光显微镜和生物活性检测器对含重组质粒pGFP_304、pGFPExpA和pGFPExpB的转化子分别进行荧光检测及微量热检测。结果表明,3种启动子驱动下的gfpmut3基因均可在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中表达并检测得到不同的发光类型。微量热法检测发现P44_12和PBtI_BtII启动gfpmut3表达的代谢热低于Pcry3A驱动gfpmut3表达的代谢热。     

人小肠三叶因子在糙皮侧耳中的整合、表达及检测

用原生质体法将含双 35S_AMV启动子及人小肠三叶因子 (hITF)cDNA的表达载体导入糙皮侧耳 (Pleurotusostreatus)中 ,原生质体转化子在含有除草剂的培养基上初步筛选 ,获得抗性菌株。通过PCR分析证明hITFcDNA已整合到侧耳基因组中。以hITF为抗原免疫家兔制备了抗血清 ,纯化后的IgG以直接型酶联免疫吸附检测 (ELISA)方法测定效价 ,并建立起hITF的竞争型酶联免疫吸附检测 (ELISA)方法 ,给出了标准工作曲线 ,以应用于大规模表达菌株的筛选确立。检测表明 ,hITF在侧耳新鲜菌丝体中分 3个表达量段 :10 0 0～ 12 5 0ng g、14 80～ 170 0ng g、最高达2 0 0 0～ 2 2 5 0ng g ,约占总可溶性蛋白的 0 7%～ 1 5 %。Western印迹进一步分析证明hITF在侧耳中的表达。     

我国禽脑脊髓炎病毒分离株全基因组的测定

测定了我国禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)分离株L2Z株的全基因组核苷酸序列.该病毒株的3′和5′非编码区核苷酸序列用3′和5′RACE(cDNA末端快速扩增)法获得.基因组全长为7 059个核苷酸残基,包括494个核苷酸残基的5′非编码区、6 402个核苷酸残基的开放阅读框和136个核苷酸残基的3′非编码区及poly(A)尾巴.与已发表的AEV疫苗株1 143的基因组序列比较发现,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为98%和97.6%.结构蛋白(VP1～VP4)中,主要宿主保护性免疫原蛋白VP1氨基酸之间差异较小.与小RNA病毒科其它病毒属相比,在非结构蛋白3D中,预测的8个RNA依赖性RNA聚合酶主要结构域中的4个高度保守.从而进一步确认了AEV的分子特性.     

罗氏沼虾诺达病毒的核酸检测及其部分序列分析

根据安替列群岛分离的罗氏沼虾诺达病毒株基因组序列(MrNV-ant),制备特异性核酸探针,设计特异性引物,用点杂交和RT-PCR的方法检测在中国境内分离的罗氏沼虾诺达病毒(MrNV-chin).点杂交的方法可以检测出少于26ng的患肌肉白浊症的组织样品中的病毒,或少于25ng的病毒RNA样品;RT-PCR可以检测出少于25pg的RNA样品.扩增的MrNV-chin RNA1序列长858个核苷酸,与MrNV-ant的核苷酸一致率为957%,两者翻译后的氨基酸序列的一致率为99.7%.扩增的MrNV-chin RNA 2序列长1121个核苷酸,与MrNV-ant的核苷酸一致率为92%,两者翻译后的氨基酸序列的一致率为93.2%.因此,MrNV-ant和MrNV-chin应属于同一种病毒的不同分离株.用两株罗氏沼虾诺达病毒的RNA聚合酶序列与其它6株诺达病毒RNA聚合酶序列比较后构建的进化树中,罗氏沼虾诺达病毒与Alphanodavirus的亲缘关系近于与Betanodavirus的亲缘,组成了一个新的分支.     

非复制重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒Bostwana C亚型Nef蛋白及免疫效果的观察

从含人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)Bostwana C亚型全基因的质粒pJM4-HIV中克隆了nef基因,并利用非复制型痘苗病毒载体构建表达Nef蛋白的重组病毒NTVJ1175nef,经PCR和Southern blot鉴定,nef基因正确整合到痘苗病毒基因组的J片段上;感染人源细胞后,经Western blot和免疫荧光检测表明,重组病毒能很好地表达Nef蛋白,并定位于细胞质中.NTVJ1175nef免疫BALB/c小鼠后,经Pep-IFN-'γ-Assay法检测,可诱导产生针对表位肽P1特异的可分泌IFN-'γ的C 8 T细胞(占脾细胞总数0.20%);经乳酸脱氮酶(LDH)法检测证实,诱导的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性地杀伤表位肽P1特异P815靶细胞.这些结果表明,NTVJ1175nef具有良好的细胞免疫原性,为下一步构建表达包含HIV早期抗原的多组分重组痘苗病毒候选疫苗奠定了免疫学基础.