8-异戊烯基柑橘素促进体外培养成骨细胞成熟矿化的研究

研究8-异戊烯基柑橘素对体外培养大鼠颅骨成骨细胞(rat skull osteoblasts,ROB)的分化成熟及生物矿化的影响.取新生大鼠颅骨多次酶消化法得到成骨细胞,培养于含10%FBS的MEM培养液中,3天后首次换液,待细胞铺满皿底传代培养.以碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)为检测指标,96孔板梯度筛选作用最佳浓度,在最佳浓度作用并成骨性诱导培养的第3、6、9、12天测ALP活性、钙盐沉积量;第12天进行ALP和钙化结节组织化学染色及计数;成骨性诱导后不同时间点提取Total RNA,RT real-time PCR法检测成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、成骨相关转录因子Osterix、Runx-2和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的基因表达情况;成骨性诱导的第4、8、12天裂解获得细胞总蛋白,蛋白质印迹法检测人Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)的蛋白质表达量.研究结果表明:1×10-6 mol/L能显著促进成骨细胞的成熟分化,表现为提高ROB的ALP活性、促进钙盐沉积、增加钙化结节数量;提高bFGF、IGF-1、Osterix、Runx-2和BMP-2 mRNA表达水平;促进COL-Ⅰ的合成.由此可知终浓度为1×10-6 mol/L 8-异戊烯基柑橘素能显著促进ROB的分化成熟及生物矿化,证明8-异戊烯基柑橘素能促进成骨细胞的分化成熟及生物矿化,作为促进骨修复和抗骨质疏松的有效成分具有较大的药用价值.     

Micro-CT辅助结肠造影在小鼠炎性肠病中的应用

用DSS喂饲小鼠建立小鼠IBD模型,在建模的第0、8、13天分别用碘帕醇灌胃加腹腔注射的方法造影并micro-CT扫描降结肠壁厚度,结果第8天和第13天分别为0.4586±0.04 mm和0.40325±0.03 mm,显著(P<0.001)大于对照组((0.28±0.02 mm).同时检测小鼠体重变化、临床评分、结肠...     

iCare眼压计测量小鼠眼压值与真实眼压的相关性研究

目的:通过前房插管技术调节小鼠眼压,研究iCare眼压计测量小鼠眼压值与小鼠真实眼压之间的相关性。方法:取20只12周龄的C57BL/6J小鼠,麻醉后行前房穿刺置管,通过改变BSS液瓶高度调节其眼压。使用iCare眼压计测量其眼压值。采用SPSS软件分析iCare眼压计测量值和小鼠真实眼压之间的相关性。结果:iCare眼压计测量值与真实眼压之间相差较大,较真实眼压低约54%-71%,然而两者之间遵循如下线性回归方程:真实眼压(mmHg)=3.3988×(iCare眼压计测量值)-5.6292,rZ=0.9506,P<0.05。结论:iCare眼压计测量值较小鼠真实眼压低,然而在应用线性回归公式的情况下,iCare眼压计的测量修正值可以反映小鼠实际眼压值。     

连续观察兔油酸ARDS模型稳定性及血L-1、IL-8近期变化

目的:探讨油酸(OA)构建兔急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型3天内的稳定性及血浆炎症因子IL-1、IL-8含量变化的意义。方法:健康新西兰大耳白兔30只随机分为5组,每组6只,实验组(n=24)耳缘静脉注射油酸(0.1mL/kg)建立ARDS模型,对照组(n=6)注射等量生理盐水。分别检测对照组6h和实验组6h、24h、48h、72h(n=6)动脉血PH值、PaO2、PaO2/FiO2、PaCO2、肺湿/干重比值(W/D),ELISA法检测血浆细胞因子IL-1、IL-8含量,HE染色观察肺组织病理学改变。结果:和对照组比较,实验组血中细胞因子IL-1在6h、24h组升高;细胞因子IL-8在6h组、24h组、48h组升高。6h组、24h组、48h组氧合指数<200mmHg。结论:兔油酸ARDS模型48h内稳定,炎性细胞和IL-1、IL-8可能是导致ARDS的发生和发展主要原因之一。     

心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的CREG 蛋白表达载体 的构建及鉴定

目的:构建心肌特异性α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)启动子启动E1A基因阻遏子(cellular repressorof E1A-stimulated genes,CREG)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合的真核表达载体。绿色荧光蛋白作为报告基因,方便在心肌细胞中直接观察CREG蛋白的表达,为心肌特异性转CREG基因动物模型制备提供载体。方法:用BamH I和EcoR I双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1中,构建pCREG-EGFP-N1;根据Genebank中公布的α-MHC基因的启动子序列,人工合成pUC57-α-MHC启动子基因序列,经Ase I和Nhe I双酶切得到启动子α-MHC,亚克隆入pCREG-EGFP-N1中替代原CMV启动子,构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1,测序鉴定。用脂质体法将该质粒转染体外培养的小鼠原代心肌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果:成功构建pα-MHC-CREG-EGFP-N1质粒,酶切及测序结果正确;成功转染入原代培养小鼠心肌细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。结论:重组质粒pα-MHC-CREG-EGFP-N1体外转染入原代培养小鼠心肌细胞后,目的基因能够在心肌细胞中有效表达,检测方法简便可靠,为下一步建立心肌细胞特异性表达CREG的过表达转基因小鼠、深入探讨CREG在心肌疾病发生中的生物学功能研究奠定了基础。     

VEGF诱导血管新生的新通路

缺血后血管新生是缺血组织血流再灌和损伤修复的关键环节。血管新生是一个涉及内皮细胞增殖、迁移和成管的复杂过程,需要多种生长因子和信号通路的参与,其中最重要的信号分子之一就是VEGF。最近,北京大学学者的研究提示,Grb-2相关接合子1(Gab1)在缺血和VEGF诱导的血管新生过程中起重要作用。这为完善血管新生的细胞内信号通路提供了新的证据。研究者发现,内皮细胞特异性敲除Gab1(EGKO)小鼠表现出肢体缺血后血管新生严重受损。分离EGKO小鼠内皮细胞体外培养同样发现,较对照组小鼠而言,基因敲除小鼠内皮细胞对VEGF诱导成管的敏感性降低,Matrigel plug assay和aorticrings assay得到一致结果。以上结果说明EGKO小鼠血管新生能力受损。研究者进一步探究其分子机制,发现在Gab1缺失     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

人类疱疹病毒8型ORF75基因亚型在鳞癌中的分布

目的:明确鳞癌感染人类疱疹病毒8型(HV-8)ORF75基因亚型分类并初步探讨其与鳞癌的相关性。方法:对40例皮肤鳞癌、46例食管鳞癌石蜡包埋组织进行HHV-8 DNA抽提、扩增、双向测序,使用DNASTAR软件、Crustal W软件和PHYLIP软件包对测序结果进行系统发生学分析,从而确定HHV-8 ORF75基因亚型,最后运用Fisher确切概率法对结果进行统计学分析。结果:①40例皮肤鳞癌有10例HHV-8感染为阳性,阳性率为25.0%;46例食管鳞癌有12例为阳性,阳性率为26.1%.②皮肤鳞癌感染HHV-8 ORF75亚型6例为A亚型,4例为C亚型;食管鳞癌感染HHV-8 ORF75亚型8例为A亚型,4例为C亚型③鳞癌感染HHV-8 ORF75基因亚型与鳞癌患者感染部位及病理分级之间没有统计学意义(P>0.05)。结论:鳞癌患者感染HHV-8 ORF75亚型属于A亚型和C亚型;鳞癌感染HHV-8 ORF75基因亚型与鳞癌患者感染部位及病理分级无关。     

不同品系小鼠对代谢性高尿酸血症造模的影响

目的:分别以昆明种小鼠及ICR、C57BL/6J小鼠为研究对象,比较在复制高尿酸血症模型时可能的小鼠品系差异,并通过降尿酸药物别嘌呤醇与非布索坦验证选择降尿酸药物筛选时选用不同品系动物造模的影响。方法:采用不同剂量次黄嘌呤腹腔注射联用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾皮下注射给药,测定不同造模时段各品系小鼠血清尿酸值。结果:ICR、C57BL/6J小鼠对高尿酸血症造模耐受显著高于昆明种小鼠,在腹腔注射次黄嘌呤500mg/kg,皮下注射氧嗪酸钾300mg/kg时,才可获得稳定的可用于药物筛选的高尿酸血症模型。结论:选择高尿酸血症在体模型时,昆明种小鼠灵敏度高于ICR小鼠以及近交系的C57BL/6J小鼠。     

大黄素对HT-29 细胞MAPKs 信号通路活化及IL-8 分泌的影响

目的:研究大黄素对IFN-和LPS刺激的人结肠癌细胞株HT-29细胞的ERK、JNK和p38 MARK和IL-8表达的影响。方法:人结肠癌细胞株HT-29细胞与40 ng/mL的IFN-共培养12 h,再加入100 ng/mL LPS刺激15 min,用大黄素预处理进行干预。ELISA检测HT-29细胞内的ERK、JNK和p38 MARK含量和细胞上清IL-8含量。结果:IFN-γ和LPS刺激后HT-29细胞的ERK、JNK和p38 MARK磷酸化水平和IL-8分泌明显升高。大黄素对p38和JNK磷酸化有明显的抑制作用,而对ERK磷酸化则没有明显抑制作用;大黄素能显著降低IFN-γ+LPS所引起的HT-29细胞IL-8的大量产生,并且呈明显的剂量依赖关系。结论:大黄素能有效抑制IFN-γ+LPS所引起的HT-29细胞p38和JNK的磷酸化,并显著降低IL-8分泌。