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目的:优化糖链结构分析方法,满足高通量、高灵敏度和快速分析糖基结构的要求。方法:基于DNA测序仪的荧光糖电泳(DSA-FACE),将糖蛋白经过糖苷酶酶切获得糖链,并与荧光标记物8-氨基芘基-1,3,6-三磺酸(APTS)进行衍生化反应,标记样品经过Sephadex-G10、HPLC纯化后,用DNA3100测序仪电泳分离,用Genescan3.7软件进行数据分析。结果:利用DSA-FACE技术分析了标准品Man5GlcNAc2和Gal2GlcNAc2Man3GlcNac2,并得到糖蛋白牛核糖核酸酶B的5种N-糖基结构(Man5~9GlcNAc2)。结论:DSA-FACE是分析糖基结构的有效技术手段,能够实现对糖基结构的高通量、高灵敏度和快速分析。 相似文献
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目的:为了延长人生长激素(HGH)在血浆中的半衰期,构建了高效分泌表达人血清白蛋白(HSA)与HGH融合蛋白(HSA-HGH)的工程毕赤酵母菌株。方法:从人胎肝cDNA文库中扩增HSA基因,从HGH工程菌载体中扩增HGH基因,将其克隆至真核表达载体pHIL-D2,载体线性化后采用电击法转化毕赤酵母GS115。通过原位双层膜法筛选高效分泌表达菌株。分别采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定融合蛋白。对工程酵母培养条件进行研究,发酵液经离子交换层析、亲和层析和分子筛层析纯化。纯化的蛋白经N端序列测定,分子量测定和等电聚焦电泳进行鉴定。冻干的蛋白制剂经食蟹猴试验进行药代动力学和药效动力学测试。结果:确立了工程酵母的最佳培养工艺,融合蛋白表达量达100mg/L。纯化后蛋白纯度达95%以上,得率达42%。融合蛋白与预期结果一致,经食蟹猴试验,显示有良好的生物活性,与等摩尔剂量的重组人生长激素相比,半衰期延长6.8倍,清除率慢44倍。结论:融合蛋白呈现明显的长效动力学特征,为开发重组长效人生长激素HSA-HGH融合蛋白药物(rHSA-HGH)奠定了基础。 相似文献
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纯化重组霍乱毒素B亚单位与天然霍乱毒素B亚单位性质的对比研究 总被引:1,自引:0,他引:1
霍乱毒素B亚单位(BS)已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体,但成本高,来源困难.用重组霍乱毒素B亚单位(rBS)代替BS可克服上述缺点.rBS用于上述目的前必须证实其在物理、化学及免疫学性质方面与天然同类产品的一致性.用亲和层析法从各批次大罐发酵所获工程菌E.coliMM2(pMM-CTB)培养物上清中制备得到了小批量rBS纯品,在同等条件下与BS(Sig-ma公司产品)进行理化、免疫学性质的对比研究,证实二者在SDS-PAGE中电泳带位置一致、分子量相同,纯度达99%;在反相HPLC中出峰行为一致,纯度达100%;在半干式聚焦电泳分析中电泳带分布相同,等电点为7.91.rBSN端起的20个氨基酸序列为TPQNITDLCAEYHNTQIHTL,与克隆基因来源株的毒素B亚单位同一段序列完全一致.氨基酸组成分析证实rBS与BS相近.在免疫学性质分析中,rBS与BS在免疫双扩散试验中与抗CT均出一条沉淀线且相互吻合;在免疫电泳试验中二者与抗CT在相应位置上产生一条沉淀弧;二者均能与神经节苷脂GM1结合且这种结合均可通过二者与抗CT的预保温处理而被阻断.对比研究结果揭示rBS与BS性质完全一致,可代替BS用于 相似文献
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外源基因在原核细胞中的表达,是基因工程和分子生物学许多研究领域中应用最为广泛的技术,大肠杆菌已成为蛋白质表达的首选宿主和生产基因工程多肽药物的主要表达系统。发展通用的高表达、可溶性以及分泌性表达策略,是目前该领域研究中的重点发展方向。实现外源基因在大肠杆菌中的分泌表达,由于对蛋白质分泌机制的基础研究还不够深入,缺乏有力的理论指导,目前还存在许多问题,急需要发展新的研究技术和思路。研究表明,表达蛋白的性质是决定它能否有效分泌的重要性质,蛋白质中少数氨基酸的改变可显著的影响其分泌情况。为了能够方便的… 相似文献
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以霍乱毒素B亚基(CTB)为载体,由其基因构建了含有不同时期不同抗原表位的恶性疟原虫的融合基因CTB~AWTE、CTB~NANP,前者除含有恶性疟原虫裂殖子表面主要抗原表位杂合多肽基因SPf66外,还含有很强的T辅助细胞表位CST3和Tc细胞表位,后者含有子孢子期的B、Th细胞表位。将纯化的质粒免疫Balb/c纯系小鼠,3次免疫后诱导机体产生了体液免疫和细胞免疫,免疫的小鼠进行疟原虫子孢子攻击实验,保护率为60%一80%。将纯化的质粒混合后免疫恒河猴,3次免疫后诱导机体产生了体液免疫和细胞免疫,免疫的恒河猴进行食蟹疟原虫攻击实验,显示了一定的保护作用。 相似文献
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质粒DNA疫苗在用于预防传染性疾病时应注意的问题 总被引:1,自引:0,他引:1
本文为生产商进行生产和临床前评价DNA疫苗提供了初步指南。为有利于生物评价和研究中心 (CBER)与生产商之间的沟通 ,对于DNA疫苗的生物学和物理特性应该有一个共同的标准。质粒DNA的定义为 :在适当的宿主系统中 ,可以生产插入在质粒DNA中所需的抗原基因。质粒DNA目前都是来自细菌质粒的组构体 ,它包含有一个或者多个传染源的基因。这些质粒包含有在细菌中所必须的选择和复制的DNA序列、真核启动子和增强子、基因表达的转录终止和poly(A)序列。有关DNA疫苗的生产、临床前的评价、临床研究的规则与其它生物产… 相似文献
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生物技术药品的产业化 总被引:1,自引:1,他引:0
生物技术产业将成为21世纪的主导产业之一,当前美国的生物技术产业化在全球居领先地位,生物技术药品产业化前景十分光明。我国生物技术药品开始实现产业化,已批准5种药品投放市场,只有十多种产品进入中试开发阶段。本文对我国生物技术药品产业化现状进行了分析,对加快产业化速度提出了意见。 相似文献