林麝γ-干扰素基因的克隆、分析及表达、纯化

以RT-PCR方法,从经ConA诱导的林麝（Moschus berezovskii）外周血淋巴细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）总RNA中扩增出编码林麝IFN-γ的基因并将其克隆到pMD18-T载体上。经筛选、菌落PCR鉴定、测序、序列分析,证实为林麝IFN-γ基因编码序列（全长498bp）。将其重组到原核表达载体pGEX4T-1,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达。表达产物以GST（Glutathione S-transferase）融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的26．9％。经NaOH法变性复性后,用GSTrap亲和柱对蛋白进行了纯化。本研究成果为进一步研究林麝IFN-γ的生物学活性及其临床应用奠定了基础． 对林麝异地保护具有重要意义。     

林麝肠道乳酸菌及肠杆菌多态性分析及耐药性研究

为研究林麝肠道中乳酸菌和肠杆菌基因型及表型多样性并对其耐药性进行分析,本研究从10头健康成年林麝粪便样品中分离到22株乳酸菌和16株肠杆菌,通过16S rDNA进化分析和生理生化测定对分离菌株进行了鉴定,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分析了分离菌株的基因型并利用药敏纸片法进行了分离菌株的耐药性研究。本研究共分离到了11种细菌,分别为大肠杆菌Escherichia coli、阴沟肠杆菌Enterobacter cloaca、河生肠杆菌E.amnigenus、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae、蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii、耐久肠球菌E.durans、明串球菌Leuconostoc fallax、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、嗜酸乳杆菌L.acidipiscis、屎肠球菌E.faecium和食窦魏斯氏菌Weissella cibaria。其中大肠杆菌(n=11,28.9%)是林麝肠道中的优势菌群,肠球菌(n=10,26.3%)是林麝肠道中的优势乳酸菌群。PFGE分型结果表明肠杆菌分为7个基因型,乳酸菌分为9个基因型。本研究首次分析了林麝肠道中可培养细菌的基因型及表型并且对其耐药性进行了测定,结果表明林麝肠道中的原生菌群多态性明显,并且对目前常用的抗生素敏感,未检测到耐药菌株。     

林麝源铜绿假单胞菌噬菌体vB＿PaeM＿PAMD02的生物学特性与全基因组序列分析

【背景】圈养林麝一半以上的死亡是由铜绿假单胞菌引起的化脓性疾病导致。另外,由于细菌的抗性增加,噬菌体是继抗生素后的另一抗菌选择。【目的】以分离自病死林麝肺脏的铜绿假单胞菌为宿主菌分离一株噬菌体,对其进行生物学特性、全基因组序列分析与体内抑菌试验。【方法】通过双层平板法分离纯化一株裂解性噬菌体,测定其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线、热稳定性、最适生长pH等生物学特性,通过电镜观察其具体形态,进行全基因组测序与序列分析,并进行小鼠体内抑菌试验。【结果】分离到一株裂解性铜绿假单胞菌噬菌体并命名为vB＿PaeM＿PAMD02,该噬菌体具有透明且边缘清晰无晕环的噬菌斑,其裂解谱较窄,最佳感染复数为0.1,裂解潜伏期为40 min,裂解暴发量较高,热稳定性较高,可耐受弱碱环境。其全基因组大小为66 264 bp,GC含量为55.59%,序列注释结果显示该噬菌体具有92个开放阅读框,不含毒力与耐药基因,属于肌尾噬菌体科。小鼠体内抑菌试验结果显示了PAMD02对其宿主菌良好的抑菌效果。【结论】本研究分离的噬菌体PAMD02有较高的裂解效率,对不利环境有较好的耐受性,不含毒力基因与耐药基因,具有应用...     

不同年龄与不同时期林麝香腺组织结构观察

本研究旨在探究林麝(Moschus berezovskii)在不同年龄和泌香期与非泌香期香腺的组织结构变化,为深入研究林麝香腺发育和麝香分泌机制提供基础资料。收集6只雄性林麝的香腺组织,包括泌香期2岁龄林麝1例,非泌香期6月龄、2岁龄、4岁龄、6岁龄和8岁龄林麝各1例,采用大体解剖、石蜡切片及常规H.E染色技术,对香腺的形态、组织特征及腺泡直径进行了比较分析。结果显示,林麝香腺位于腹部阴囊与腹脐之间,与阴囊的距离约为4.5 cm。根据功能,香腺可划分为香囊部和腺体部。负责分泌麝香液的腺体组织为肉眼可见的白色颗粒,嵌入腺体部肌层深处并环绕香囊颈分布。6月龄林麝香腺已具有成熟腺体结构,但腺上皮仍处于休止状态;成年林麝香腺的腺泡则增大且数量增多。成年林麝泌香期腺泡被挤压成团状分布,上皮游离面破碎不整,腺泡腔内含有大量明显的颗粒状分泌物与细胞碎屑混合堆积;非泌香期腺泡直径显著大于泌香期(P < 0.01),2岁林麝腺泡表现为紧密排列的椭球形,而4岁及以上的腺泡则呈不规则团状分布,腔内可见颗粒物,且4岁、6岁和8岁的腺泡直径无显著差异(P > 0.05)。林麝香腺组织结构的变化反映了泌香能力与生长阶段的关系。     

雄激素诱导林麝二次泌香实验研究

应用初始量50毫克、间一日递增25毫克肌注丙酸睾丸酮诱导雄麝产生第二次泌香,其泌香反应发生率达91％,平均可增产麝香76.91％。诱导后对次年自然泌香节律无影响,且能使次年自然泌香量增加26.9％以上。     

成年与未成年圈养林麝粪便菌群多样性的比较

本研究旨在解析林麝未成年组(n=10)和成年组(n=10)之间的菌群差异。收集林麝新鲜粪便,提取总DNA,利用带标签的通用引物扩增16S rRNA V3-V4区,使用Illumina Miseq 300PE测序平台对扩增产物进行Miseq双端测序,通过计算ACE和Shannon等多样性指数,以及微生物组成成分和距离聚类分析,揭示组成结构与差异。α多样性分析表明成年组微生物的多样性丰富度略高于未成年组,但不存在显著差异性(P>0.05)。未成年组和成年组均是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)所占的比例较高。成年组Proteobacteria比例明显高,而Firmicutes比例较低。LEfSe分析表明有12个显著差异的细菌分类。两组在Firmicutes门存在显著差异的细菌较少,而在Proteobacteria上存在显著差异的细菌较多。本研究证明在不同年龄阶段,微生物的丰富度和多样性不存在显著差异,细菌的组成成分也相同。但是在组成比例上存在差异性,间接反映了不同年龄阶段营养吸收的不同需求。     

圈养林麝夏季昼夜活动节律及时间分配

2011年、2012年的5～7月每月定期8天,每天00:00～24:00采用行为取样法在米亚罗养麝场观察记录54只林麝(15只成体雌麝,9只成体雄麝,10只亚成体雌麝,5只亚成体雄麝,15只幼麝)的行为。夏季共记录林麝83种行为,分成5种行为类型,即摄食、运动、休息、反刍及其他行为。夏季林麝具有明显的昼夜活动节律性,晨昏出现2个活动高峰期,分别为5:30～8:00和18:00～21:00,白昼活动率低于夜间。根据夏季林麝各行为累计时间和频率比较,表明圈养林麝的休息行为较高,尤其是幼体(65.38%±5.39%vs16.41h/d±1.29h/d),其次是摄食和运动行为。成体雌麝摄食行为比率高于成体雄麝、亚成体和幼体,这与夏季成体雌麝哺乳所需的能量较高有关。     

某林麝场林麝感染假结核耶尔森菌的诊治

为寻求四川宝兴某家养林麝死亡的原因及控制措施,采集一例病死林麝各组织器官进行病理切片观察和细菌分离,对分离到的病菌进行形态学观察、16S rDNA序列分析、小鼠致死试验、生化鉴定及药敏试验。结果显示,切片中各组织含有大量细菌团;从肠系膜淋巴结、肝、脾、肾和肺中只分离到1株病菌;16S rDNA测序分析发现该菌与耶尔森菌16S基因的相似性高达100%,生化及鉴别试验最终判定为假结核耶尔森菌。该菌对头孢噻肟、头孢西丁、丁胺卡那霉素等药物敏感。结果证实,此次林麝死亡的原因为假结核耶尔森菌引起的败血症,并及时应用敏感抗生素控制了病情。     

一株林麝肺源创口博德特氏杆菌全基因组及细胞致死性肿胀毒素分析

【目的】为探究林麝的死亡原因,本研究无菌采集1只死亡林麝肺脏后进行细菌的分离鉴定。【方法】通过细菌分离纯化、生化试验和16S rRNA序列分析,对分离菌株进行鉴定;然后通过药敏试验、全基因组测序与分析以及细胞致死性肿胀毒素(cytolethal distendin toxin subunit B,CDTB)分析,对分离菌株耐药性和致病性进行研究。【结果】在死亡林麝肺脏中分离出1株革兰阴性菌,经鉴定为创口博德特氏杆菌,命名为ZL0001。经过细胞培养观察和CDTB分析表明该菌为胞内寄生菌,含有细胞致死性肿胀毒素,能导致细胞凋亡。药敏结果表明该分离株对氨苄西林、亚胺培南、链霉素和四环素等药物敏感;对氨曲南、林可霉素、克林霉素和呋喃妥因耐药。全基因组测序分析结果表明,该菌株与其他创口博德特氏杆菌的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)值均97%,基因组大小为4350644 bp,共发现22个耐药相关基因。此外,该菌株基因组包含63个毒力相关基因,其参与鞭毛蛋白、脂多糖、铁摄取、抗血清蛋白以及细胞致死性肿胀毒素等毒力因子的合成。【结论】本研究首次在动物呼吸道中分离出创口博德特氏杆菌,并证明其为胞内寄生菌,对林麝肺炎的发病机理研究具有重要意义。