Inefficiency of Sera from Mice Treated with Pseudotyped SARS-CoV to Neutralize 2019-nCoV Infection

The novel coronavirus 2019-nCoV has caused the pandemic of Wuhan pneumonia recently, posing a serious threat to global public health, and thus calling for the development of therapeutics and prophylactics. Here we showed that high titer anti-SARS-CoV spike protein serum cannot effectively neutralize 2019-nCoV infection. Based on our previous research, we developed SARS pseudovirus (SARS-PsV) and MERS pseudovirus (MERS-PsV) as immunogens to immunize mice. We found sera from mice treated with SARS-CoV S protein could potently cross-neutralize infection by SARS-CoV (50% neutralizing antibody titers, NT50 > 40, 000) and SARS-related coronavirus (NT50 > 7, 000), but weakly for 2019-nCoV infection NT50 < 100), implying that it may not be practical to treat 2019-nCoV infection with anti-SARS-CoV antibodies and that people with history of SARS-CoV infection many years ago may not be resistant to 2019-nCoV infection.     

SARS冠状病毒N蛋白与γ血红蛋白的相互作用

目的:研究SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)与γ血红蛋白的相互作用。方法:利用免疫共沉淀实验验证SARS-CoV N蛋白与γ血红蛋白存在相互作用,并通过Western印迹检测SARS-CoV N蛋白对细胞内γ血红蛋白表达量及稳定性的影响。结果:SARS-CoV N蛋白与γ血红蛋白的相互作用能使SARS-CoV N蛋白抑制γ血红蛋白在293细胞中的泛素化,提高γ血红蛋白在293细胞中的稳定性,从而使γ血红蛋白在细胞内的表达量显著提高。结论:SARS-CoV N蛋白能与γ血红蛋白在细胞内形成复合物,为揭示SARS-CoV在婴幼儿群体中致病率较低的机理提供了实验基础。     

SARS-CoV中和抗体保护恒河猴等感染SARS-CoV研究

[目的]阐明SARS病毒感染后能否再次感染,疫苗产生的抗体中长期保护效果,被动免疫是否真正安全有效等,为防治SARS提供实验依据。[方法]实验分4组,分别为一组(SARS恒河猴恢复组):用感染SARS-CoV发病12月后的4只恒河猴,均有中和抗体产生。二组(SARS食蟹猴恢复组):用感染SARS-CoV发病12月后的3只食蟹猴,均有中和抗体产生。三组(SARS血清输入恒河猴组):3只恒河猴,病毒接种时中和抗体阴性。病毒接种两天后输入抗体阳性血清(恒河猴血清,感染获得,效价为:1:128),用量10ml/只,分别经肌肉和静脉输入,各5ml。四组(恒河猴SARS-CoV感染组):2只恒河猴,病毒接种时中和抗体阴性。SARSCo-V经鼻腔接种,在感染的第1天开始到7天安乐死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和中和抗体测定。[结果]一组(SARS恒河猴恢复组):接种SARS-CoV后未见发热等异常临床表现。血清生化无ALT、LDH、CK、总蛋白和血清白蛋白异常。3只猴在接种病毒后的咽拭子中,RT-PCR分别未检出、第1天检出、第1-3天中检出病毒。第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。2只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎。二组(SARS食蟹猴恢复组):接种3只未见任何不良临床表现,血清生化5项正常。3只猴在接种病毒后的咽拭子标本中,RT-PCR分别未检出SARS病毒、在第1-2天检出、在第1-3天中检出病毒。第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。3只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎等。三组(SARS血清输入恒河猴组):3只恒河猴在病毒接种的第2-5天时有一过性的体温升高,3940℃。血清生化5项正常。3只猴在接种病毒后的咽拭子标本中,RT-PCR分别在第1-3、第1-4天和第1-2天检出SARS病毒。2只猴第7天咽拭子中病毒分离阳性。另外1只在第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。3只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎等。四组(SARS恒河猴SARS-CoV感染组):2只猴病毒接种后,第2-4天时有一过性的体温升高,3940℃。2只进行接种病毒后1-7天安乐死时,RT-PCR在恒河猴的咽拭子标本中连续检出SARS病毒。在第2、5天咽拭子中、7天安乐死时肺组织中病毒分离阳性。2只猴肺等组织病理学检查发现肺组织表面局部有轻度发灰实变现象,可见到间质性肺炎病变,内皮细胞受损,出血和水肿。大多数肺泡没有完整的内衬细胞残留,肺泡间隔变宽并被以吞噬细胞为主的单核炎症细胞浸润,同SARS肺炎改变。实验表明,前期感染产生中和抗体的恒河猴、食蟹猴再次感染病毒,和模型对照猴比较,动物肺组织等只出现轻微或无病理变化,RT-PCR检出时间大大缩短,病毒培养未能分离出病毒,所有这些指标,均证实中和抗体有明显的保护作用,是有效的。被动免疫从结果来看,有一定的作用,但保护作用弱。     

SARS冠状病毒M蛋白的原核表达及其DNA疫苗构建

为探讨SARS-CoV的M蛋白的免疫学特性以及M蛋白作为SARS-CoV病毒疫苗组分的可行性和必要性.分别用pET-15b和pET-22b在大肠杆菌中表达SARS-CoV的M蛋白,亲和层析纯化后作为抗原应用.同时,将M蛋白的编码基因克隆进分泌型真核表达载体pSecTagB中得到重组质粒pSecM作为DNA疫苗,免疫BALB/c小白鼠、制备SARS-CoV M蛋白的抗血清.并用纯化后的M蛋白建立的SARS-CoV M抗体ELISA检测技术研究所构建的M-DNA疫苗的免疫效果.结果表明:两种重组M蛋白在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,经与华大产的用灭活SARS全病毒制备的SARS-CoV抗体ELISA检测试剂盒比较实验,证明该原核表达的重组M蛋白能与SARS确诊病人血清以及M-DNA免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应.这两种重组M蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS-CoV检测中;所构建的SARS-CoV的M基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,提示M蛋白在SARS-CoV疫苗尤其是组分疫苗的研制中应加以考虑,为DNA疫苗的开发提供了依据.     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RTPCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severeacuterespiratorysyndromeassociatecoronavirus,SARSCoV)核酸。筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RTPCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性。实验结果表明:本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好。本研究建立的TaqMan荧光定量RTPCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测。     

SARS冠状病毒M基因的克隆及其表达

从SARS冠状病毒(GD322株)组织培养上清中提取RNA,进行RTPCR扩增其M基因并克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZaB,电穿孔法将重组体整合人酵母菌P．pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut^-菌用甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测其表达产物。Mut^-酵母转化菌经甲醇诱导可分泌表达约65kDa和42kDa的蛋白质,与SARS恢复期病人血清的免疫印迹证实它们为特异的重组M蛋白质,且获得的重组M蛋白质具有免疫反应性。     

广东地区SARS-COV细胞培养模型的建立和初步应用

目的：建立中国广东地区SARS—CoV细胞培养模型。方法：通过将SARS—CoV广东地区分离株GD322在Vero E6细胞中连续传代,检测TCID50,获得稳定的细胞模型。利用此细胞培养模型,对不同温度、紫外线等条件下SARS-CoV的存活时间进行了比较。对重组人复合干扰素α抗病毒效果进行了筛查。结果与结论：SARS—CoV对外界环境抵抗力比普通冠状病毒强,对重组人复合干扰素α有较高的敏感性,抑制指数达4．9。     

马抗SARS-CoV免疫球蛋白对SARS-CoV GZ-01株中和作用的研究

观察马抗SARS-CoV免疫球蛋白对SARS-CoV GZ-01毒株的中和作用,为马抗SARS-CoV免疫球蛋白用于SARS的治疗提供科学的依据。采用CPE、MTT测定马抗SARS-CoV免疫球蛋白对SARS-CoV GZ-01株的中和作用。结果显示,马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab’)2治疗性抗体对SARS-CoV GZ-01株具有很好的中和作用,三批马抗SARS-CoV免疫球蛋白的CPE和MTT中和效价分别达到1:6400、1:6400、1:12800,且两种方法测得结果一致。     

SARS病毒S蛋白片段的克隆表达和纯化

以大肠杆菌表达载体pET22b为载体,直接表达SARS病毒S蛋白425-569及894-1033等2片段。表达所获得的包涵体形式蛋白经尿素溶解后分别经过2次离子交换层析,获得初步纯化。在酸性和低尿素浓度环境中,2种S蛋白片段极易沉淀。Western印迹鉴定显示其与抗SARS病毒血清呈阳性反应。获得的纯化蛋白可用于检验受体结合能力等研究。     

A conserved RNA pseudoknot in a putative molecular switch domain of the 3'-untranslated region of coronaviruses is only marginally stable

The 3'-untranslated region (UTR) of the group 2 coronavirus mouse hepatitis virus (MHV) genome contains a predicted bulged stem-loop (designated P0ab), a conserved cis-acting pseudoknot (PK), and a more distal stem-loop (designated P2). Base-pairing to create the pseudoknot-forming stem (P1(pk)) is mutually exclusive with formation of stem P0a at the base of the bulged stem-loop; as a result, the two structures cannot be present simultaneously. Herein, we use thermodynamic methods to evaluate the ability of individual subdomains of the 3' UTR to adopt a pseudoknotted conformation. We find that an RNA capable of forming only the predicted PK (58 nt; 3' nucleotides 241-185) adopts the P2 stem-loop with little evidence for P1(pk) pairing in 0.1 M KCl and the absence of Mg(2+); as Mg(2+) or 1 M KCl is added, a new thermal unfolding transition is induced and assignable to P1(pk) pairing. The P1(pk) helix is only marginally stable, ΔG(25) ≈ 1.2 ± 0.3 kcal/mol (5.0 mM Mg(2+), 100 mM K(+)), and unfolded at 37°C. Similar findings characterize an RNA 5' extended through the P0b helix only (89 nt; 294-185). In contrast, an RNA capable of forming either the P0a helix or the pseudoknot (97 nt; 301-185) forms no P1(pk) helix. Thermal unfolding simulations are fully consistent with these experimental findings. These data reveal that the PK forms weakly and only when the competing double-hairpin structure cannot form; in the UTR RNA, the double hairpin is the predominant conformer under all solution conditions.